Studio pilota per mettere a punto una strategia di mappatura dei microbiomi in formaggi a latte crudo per la predizione del profilo di rischio biologico

1. Scopo. L’analisi longitudinale dei microbiomi negli alimenti durante il processo produttivo consente di valutare i cambiamenti nelle popolazioni microbiche che possono favorire la colonizzazione dei patogeni. 2. Metodi. In questo studio pilota sono stati caratterizzati i microbiomi di 28 campioni dello stesso lotto di formaggio e 3 campioni ambientali prelevati in una azienda lattiero casearia della regione Emilia Romagna. I campioni analizzati sono stati latte crudo (n=3), latte caldo (n=1), siero (n=3), liquido di salamoia (n=1), cagliata (n=3), formaggio post stufatura (n=1), formaggio post salamoia (n=1), formaggio post anti-muffa (n=1), formaggio dopo 7, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 giorni di stagionatura, testato sia internamente (1 campione per ogni tempo) che sulla crosta (1 campione per ogni tempo). I tre campioni ambientali sono stati ottenuti da tamponi di tombini nella zona di produzione (1 pool di 5 tamponi) e sulle assi per la stagionatura a 3 e 75 giorni. Tutti i campioni raccolti sono stati sottoposti ad estrazione del DNA, preparazione di librerie e shotgun sequencing sulla piattaforma Illumina NovaSeq 6000. La classificazione tassonomica è stata effettuata mediante il tool kaiju contro la reference nr_euk dopo avere ripulito le sequenze dal genoma dell’ospite (Bos taurus). L’analisi di correlazione tra microbiomi è stata condotta a livello di genere mediante R applicando la funzione cor (pacchetto stats, method: pearson). Nei campioni di latte e derivati sono stati ricercati con metodo colturale Salmonella, Campylobacter, Listeria monocytogenes e Staphylococcus aureus. Nei campioni ambientali soltanto Listeria monocytogenes. 3. Risultati. I genera dominanti nei microbiomi del latte crudo sono risultati Lactococcus, Pseudomonas ed Acinetobacter, mentre nella cagliata e nel formaggio durante la stagionatura i genera principali erano Lactococcus, Streptococcus e Lactobacillus. I microbiomi dei campioni caratterizzati durante il processo produttivo sono risultati correlati tra loro in misura variabile, ad eccezione del liquido di salamoia non correlato agli altri campioni. I microbiomi dei tamponi effettuati nei tombini sono risultati correlati con quelli di latte crudo e latte caldo, mentre quelli sugli assi di stagionatura a 75 giorni sono risultati correlati con i microbiomi della crosta del formaggio allo stesso tempo di stagionatura, con una chiara presenza, in entrambi i campioni, di Penicillium. I microbiomi identificati nelle tre unità campionarie di siero e cagliata sono risultati completamente sovrapponibili, mentre per i campioni di latte la sovrapposizione non è sempre osservata. In relazione ai patogeni, l’analisi colturale ha evidenziato solo la presenza di Staphylococcus aureus, mentre Salmonella, Campylobacter e Listeria monocytogenes sono sempre risultati non rilevabili in 25 g o ml di campione. L’analisi dell’abbondanza delle reads dei patogeni descritti ha mostrato valori >60 rpm (reads per million) solo per S. aureus. 4. Conclusioni. Lo studio longitudinale dei microbiomi durante il processo produttivo consente di monitorare la dinamica delle popolazioni microbiche e di colonizzazione dei patogeni responsabili di malattie a trasmissione alimentare. Le attività di questo progetto sono state finanziate dal progetto MASAF, Contratto di Filiera, Stalla Modello, DM n. 0673777 del 22/12/2021, V Avviso n. 0182458 del 22/04/2022 e s.m.