Elementi per un’analisi del rischio da consumo di vongole veraci della Sacca di Goro: prevalenza e quantificazione dei ceppi enteropatogeni di Vibrio parahaemolyticus

Introduzione Vibrio parahaemolyticus è un bacillo gram-negativo, alofilo, naturalmente presente nelle acque marine e di estuario ed è riconosciuto responsabile di zoonosi alimentari in tutto il mondo. I molluschi bivalvi, in quanto filtratori, possono concentrare questo batterio fino a 100 volte rispetto all’ambiente circostante, pertanto vongole ed ostriche, che vengono spesso consumate crude, rappresentano alimenti potenzialmente in grado di veicolarne dosi infettanti [1]. Generalmente gli isolati ambientali della specie V. parahaemolyticus non posseggono i caratteri di patogenicità correntemente considerati, ovvero uno o entrambi i determinanti che codificano per l’emolisina TDH (thermostable direct hemolysin) e TRH (thermostable-related hemolysin) rispettivamente, ed in tali condizioni non causano alcuna infezione [2]. L’infezione conseguente al consumo di alimenti contaminati da ceppi patogeni si presenta generalmente come una gastroenterite di lieve o moderata entità ed autolimitante, con meno del 40% di casi richiedenti ospedalizzazione e/o terapia con antibiotici. Tuttavia, in individui particolarmente suscettibili, l’infezione può esitare in setticemia. I soggetti particolarmente a rischio sono quelli con diabete, gravi epatopatie o nefropatie, cancro, nonché quelli con compromissione del sistema immunitario conseguente ad infezione da HIV o terapie immunosoppressive. Inoltre, sono segnalati rari casi di infezioni di ferite [3-4]. Secondo uno studio della Food and Drug Administration, U.S, [5], una dose infettante pari a 108 microrganismi in totale può causare infezione nel 50% degli individui, mentre una dose pari a 103-104 ha una scarsissima probabilità di causare infezione (p<0,001). Solo per alcuni sierotipi come O3:K6, la dose infettante può risultare anche inferiore a 104 [6]. Al fine di delineare elementi utili ad un’analisi del rischio connesso al consumo di vongole veraci crude o poco cotte di produzione nazionale, in questa sede vengono presentati i dati di prevalenza e quantitativi, relativi ai ceppi enteropatogeni di V. parahaemolyticus (tdh+ e/o trh+), ottenuti nell’ambito di un monitoraggio pluriennale sulle vongole veraci della Sacca di Goro. Summary Vibrio parahaemolyticus is a halophilic gram-negative bacillus, naturally present in the marine and estuarine environment, and it is recognized as a food-borne pathogen worldwide. Filter feeding shellfish can concentrate pathogenic bacteria as much as 100-fold from the overlying water, consequently, clams and oysters, that are often consumed raw or undercooked, may represent a source of infectious doses of the entero-pathogenic strains, currently identified by the presence of one or both genes encoding for the hemolysins TDH (thermostable direct hemolysin) and TRH (thermostable-related hemolysin) respectively. V. parahaemolyticus-associated gastroenteritis is usually mild to moderate and self-limited, although the infection may be severe in persons with chronic medical disease. In this study, the prevalence of enteropathogenic strains (tdh+ and/or trh+) resulted 24%, with a mean load of 2,71±0,67 log10 CFU g-1 for the Manila clams harvested in the Sacca di Goro, Italy. An intake of 250 g of these clams (32,5 g of net weight) may result non-hazardous for healthy consumers, harboring 103 pathogenic V. parahaemolyticus, namely in the range of 103-104, a total dose that have been considered significantly noninfectious (p<0,001). Materiali e metodi Tra il 2010 ed il 2018 sono stati analizzati nell’arco delle diverse stagioni, 101 campioni di vongole veraci provenienti dalla Sacca di Goro. La ricerca di V. parahaemolyticus è stata effettuata mediante semina diretta su CHROMagar™ Vibrio, e gli isolati sospetti sono stati confermati a livello biochimico e genomico mediante PCR utilizzando il toxR come marcatore di specie, tdh e trh come marcatori di patogenicità, seguendo un protocollo riportato in precedenza [7]. L’incidenza di V. parahaemolyticus (toxR+) è stata espressa come numero di campioni positivi sul totale degli esaminati, mentre i valori di abbondanza, come Unità Formanti Colonia (UFC g-1). La prevalenza dei ceppi tdh+ e/o trh+ è stata valutata anche da un punto di vista quantitativo nei singoli campioni. Tutti i valori sono stati trasformati in logaritmo prima di calcolare la media. La valutazione quantitativa dei ceppi enteropatogeni rappresenta un dato essenziale per stabilire se una porzione di vongole può effettivamente veicolare una dose infettante di ceppi enteropatogeni. Allo scopo è stata considerata una porzione di vongole di 250 g lordi, valutando la parte edibile pari al 13% come altrove riportato per le vongole veraci dell’Adriatico [8], corrispondente a 32,5 g. Risultati e discussione Complessivamente sono risultati positivi per V. parahaemolyticus totali (toxR+) il 43,5% dei campioni esaminati (44 su 101), di cui il 93% (41 su 44) riferiti a campionamenti effettuati nei mesi più caldi (aprile-ottobre), mentre i valori di abbondanza sono risultati mediamente pari a 2,70±0,74 log10 UFC g-1. Il 45,5% dei campioni positivi per V. parahaemolyticus totali (20 su 44) è risultato negativo per ceppi patogeni, mentre il 54,5% (24 su 44) è risultato positivo per i marcatori tdh+ e/o trh+. Tali risultati sono sostanzialmente in linea con quanto riportato in uno studio precedente condotto nella stessa area [9]. In particolare, 9 campioni sono risultati positivi per ceppi con doppio marcatore, 10 per ceppi con il solo marcatore trh, 5 per ceppi con il solo marcatore tdh ed 1 solo campione con compresenza di ceppi tdh+ o trh+. Considerato l’intero campionamento, la prevalenza dei ceppi patogeni è risultata del 24% (24 su 101), con valori di abbondanza mediamente pari a 2,71±0,67 log10 UFC g-1. Per un approccio all’analisi del rischio da consumo di vongole crude o poco cotte, la dose di intake considerata pari a 32,5 g di vongole (13% di una porzione lorda di 250 g) può contenere, secondo i nostri dati, una quantità totale di ceppi patogeni pari mediamente a 103 in totale, ovvero nel range 103 - 104 cui viene attribuita una scarsissima probabilità di causare infezione (p<0,001) [5]. Attualmente, la normativa Europea non contempla V. parahaemolyticus fra i criteri di sicurezza applicabili ai molluschi bivalvi, ma non è raro che l’Autorità Competente, così come gli acquirenti della Grande Distribuzione Organizzata, dispongano controlli in tal senso. Gli accertamenti ufficiali vengono eseguiti prevalentemente con il metodo presenza/assenza l’ISO 21872-1:2017 [10], mentre in fase di autocontrollo viene spesso a mancare anche la caratterizzazione genomica. In tali condizioni il lotto viene considerato comunque non conforme, con conseguente allerta, ritiro e richiamo. Considerato che V. parahaemolyticus è un contaminante acquisito nelle aree di produzione, e che il trattamento di depurazione risulta sostanzialmente inefficace come per tutti i membri del genere Vibrio, per una corretta gestione del rischio i Controlli Ufficiali andrebbero primariamente disposti nelle zone di produzione, ed andrebbero svolti con un approccio qualitativo e quantitativo quale quello da noi utilizzato. D’altra parte, il metodo quantitativo ISO/NP TS 21872-2 [11], risulta attualmente “under development”. Nell’area da noi considerata, in un arco di ben 10 anni, le vongole veraci hanno presentato valori di contaminazione che indicano una dose di intake con scarsissima probabilità di causare infezione e questo fatto, surrogato da Controlli Ufficiali, potrebbe non solo essere davvero utile in senso epidemiologico e per una corretta analisi del rischio, ma addirittura rappresentare una forma di promozione della produzione nazionale. Ciò non toglie che sia opportuno indicare in etichetta “da consumarsi previo cottura”, mentre sarebbe auspicabile una campagna informativa rivolta ai soggetti particolarmente a rischio per questo come per altri patogeni opportunisti.