Set up dell’analisi di genescanning per l’identificazione delle mutazioni somatiche del mastocitoma canino.

E’ stata disegnata una coppia di primer che consentisse di amplificare mediante PCR la regione di DNA corrispondente all’esone 11 ed alla porzione 5’ dell’introne 11 di c-KIT comprendente sia le regioni delle mutazioni internal tandem duplications (ITDs) sia piccole delezioni di 3-6 bp3,4,6. Il primer forward è stato marcato in posizione 5’con fluoroforo 6-FAM. Sono stati inclusi nella messa a punto del test genetico 5 casi di mastocitomi canini spontanei ed 1 tessuto canino normale come controllo negativo. In 1 caso il DNA è stato estratto sia da sezioni di tessuto fissato in formalina ed incluso in paraffina sia dal corrispondente tessuto congelato a -80°C, in altri casi il DNA è stato estratto dal vetrino fissato e colorato con May Grunwald-Gimsa sia dal materiale strisciato e non colorato. Il DNA è stato poi amplificato mediante PCR su termociclatore Eppendorf EP Gradient S. Successivamente 1 l del prodotto di PCR opportunamente diluito a concentrazioni variabili tra 1:20 e 1:40 è stato aggiunto a 20 l di formamide e 0.1 l di size standard. Il campione è stato poi analizzato in doppio con sequenziatore automatico ABI Prism 310 (Applied Biosystem) fornito di capillare di 47 cm di lunghezza caricato con Performance Optimized Polimer-4 alle condizione di iniezione di 15 KV per 5 secondi; il risultato analizzato con software dedicato GeneMapper HID v.3.2. La PCR ha consentito di amplificare un prodotto di peso atteso di 201 bp corrispondente all’allele wild type sia nel controllo negativo sia in tutti i tessuti di mastocitoma. In due casi l’analisi ha evidenziato un secondo picco di peso 240 bp e 249 bp. Tali risultati hanno chiaramente permesso di individuare nei due casi una mutazione ITD. I risultati prodotti dall’analisi della sezione istologica sono risultati del tutto identici a quello ottenuto dal corrispondente campione congelato.