ELEMENTI NON CODIFICANTI CONSERVANO UNA FUNZIONE REGOLATORIA DAGLI INVERTEBRATI AI VERTEBRATI

Il genoma umano contiene migliaia di sequenze non codificanti altamente conservate tra specie diverse di vertebrati. Questi elementi altamente conservati non codificanti (CNEs) sono caratterizzati da una forte associazione spaziale con geni coinvolti nella regolazione trascrizionale e/o nello sviluppo embrionale. L’alto livello di conservazione di tali sequenze verosimilmente riflette un ruolo in funzioni chiave per l’organismo nonchè la presenza di meccanismi molecolari ugualmente conservati tra i vertebrati. Recentemente, per numerose CNEs, è stata dimostrata una attività di tipo “enhancer” tessuto-specifica, mediante saggi funzionali in vivo in embrioni di zebrafish. Nonostante la forte conservazione di sequenze tra vertebrati, non sono mai state individuate sequenze omologhe negli invertebrati. Mediante uno studio bioinformatico preliminare è stata realizzata una analisi comparativa di sequenze tra i genomi di due specie di Ciona (Ciona intestinalis e Ciona savignyi) che ha permesso di identificare CNEs conservate tra le due specie di invertebrato e localizzate nelle vicinanze degli stessi geni coinvolti nello sviluppo embrionale associati alle CNEs dei vertebrati. A partire da questa osservazione, abbiamo formulato l’ipotesi che esistano CNEs di invertebrati la cui funzione (ma non la sequenza) sia conservata anche nei vertebrati. Il lavoro sperimentale ha portato al clonaggio in vitro mediante PCR di 19 su 21 CNEs sinora descritte in Ciona. Allo scopo di verificare se tali sequenze potessero mantenere una funzione regolatoria nei vertebrati, abbiamo effettuato saggi funzionali per il monitoraggio di una eventuale attività enhancer in embrioni di zebrafish, co-iniettandoli con la CNE di interesse e un costrutto caratterizzato dalla presenza di un gene reporter (GFP, green fluorescent protein) posto sotto il controllo del promotore della beta-globina umana. Abbiamo individuato due elementi che mostrano una significativa attività enhancer tessuto-specifica, uno associato ai geni Meis e l’altro associato a Pax6. L’analisi bioinformatica e i saggi funzionali in vivo hanno quindi permesso di dimostrare una conservazione a livello funzionale, ma non di sequenza, di elementi regolatori tra vertebrati e invertebrati. Le CNEs potrebbero quindi rappresentare una famiglia di elementi regolatori conservati lungo l’evoluzione che utilizzano in parte un linguaggio che potrebbe non coincidere con la conservazione della sequenza, ma che viene riconosciuto dal macchinario regolativo all’interno della cellula.