Caratterizzazione biologico-molecolare di isolati di fitoplasmi

I fitoplasmi sono procarioti privi di parete cellulare, appartenenti alla classe dei Mollicutes e filogeneticamente correlati a batteri Gram-positivi. La difficoltà nel coltivarli in substrato artificiale ha portato nel tempo a sviluppare tecniche sempre più complesse e accurate di analisi molecolare per la loro identificazione e classificazione, basate sul gene ribosomico 16S, e confermate dall’impiego di numerosi altri geni conservati a livello di ‘Candidatus’ genere. Negli ultimi anni tuttavia sono state messe a punto tecniche che permettono, grazie al supporto di substrati artificiali complessi, l’isolamento e la crescita di vari fitoplasmi da materiale vegetale infetto, sia mantenuto in micropropagazione (Catharanthus roseus, vinca) che raccolto in campo (vite). In questo lavoro si sono perfezionate alcune condizioni di crescita e si sono studiate alcune caratteristiche biologiche di isolati di fitoplasmi volte alla loro caratterizzazione biologica ed al loro differenziamento all’interno del gruppo di Mollicutes. In particolare sono stati sperimentati diversi substrati liquidi e solidi per la crescita ed il mantenimento di ceppi di fitoplasmi, precedentemente isolati da viti sintomatiche infette su substrati CB. I vari substrati differivano per diverse combinazioni di antibiotici; differenti fonti di carbonio e concentrazione di NaCl. La valutazione della loro “performance” è stata effettuata mediante osservazione visiva del grado di torbidità del substrato dovuto alla presenza di microorganismi contaminanti e/o simbionti presenti nel tessuto di isolamento (substrati liquidi) e dalla presenza di colonie con morfologia simile a quella dei fitoplasmi (substrati agarizzati). Per confermare i risultati ottenuti dall’osservazione visiva ed al microscopio ottico, le colonie con morfologia caratteristica sono state sottoposte ad estrazione di acidi nucleici mediante kit commerciali (DNeasy Plant Mini Kit, Quiagen, USA) e ad analisi molecolare PCR “nested” seguita da RFLP e/o da sequenziamento, che hanno confermato l’identità dei fitoplasmi in coltura. Sono inoltre stati effettuati saggi di tipo biochimico per valutare in particolare la capacità di questi microorganismi in coltura di fermentare il glucosio e presentare attività dovuta alla presenza di arginina deidrolasi. I risultati ottenuti hanno permesso di differenziare i fitoplasmi in coltura da colture di controllo di Acholeplasma laidlawii ceppo ACC # 1039, gentilmente fornito da dr. M. Kube (Thünen-Istituto di Genetica Forestale, Großhansdorf, Germania).