La validazione dei protocolli di diagnosi secondo standard europei (ISO/IEC standard 16140:2003 e 17025:2005; EPPO standard PM7/76-4 e PM7/98-2), rappresenta un aspetto di fondamentale importanza nell’ambito della diagnosi fitopatologica. L’uso di protocolli validati è, infatti, alla base di un’efficiente applicazione delle misure fitosanitarie, garantendo una maggiore affidabilità dei risultati diagnostici ottenuti e la loro confrontabilità, quando prodotti in laboratori diversi ed in diverse condizioni operative. Negli ultimi anni, diversi progetti a livello europeo (Euphresco-FRUITPHYTOINTERLAB, -GRAFDEPI, -GRAFDEPI2) e nazionale (ARON-ARNADIA) hanno riguardato la validazione di protocolli per la diagnosi di patogeni vegetali. Il Progetto Finalizzato ASPROPI, recentemente finanziato dal MiPAAF, ha costituito la naturale prosecuzione dell’attività già svolta nell’ambito del progetto ARON-ARNADIA, avente come obiettivo quello di fornire linee guida per il rilevamento e l’identificazione di patogeni delle piante (funghi, batteri, fitoplasmi, virus e viroidi) ai laboratori preposti alla diagnosi degli organismi di qualità e/o quarantena, presenti sul territorio italiano. Con riferimento ai fitoplasmi, il progetto ha riguardato la validazione di protocolli per la diagnosi dei fitoplasmi agenti della flavescenza dorata (FD) della vite. La scelta delle metodologie diagnostiche da validare e la definizione dei parametri di validazione è scaturita dal lavoro congiunto di un Gruppo di lavoro di esperti costituito da varie istituzioni scientifiche di comprovata esperienza nello studio di tale patogeno. Complessivamente sono stati validati 3 protocolli molecolari, includenti: i) due protocolli TaqMan® real time PCR (qPCR) per la diagnosi multipla di FD, legno nero (LN) ed un controllo endogeno di cui, uno con kit commerciale sviluppato da IPADLAB (metodo 1) ed uno secondo la procedura descritta in Angelini et al. (2007) (metodo 2) e ii) un protocollo basato su tecnica LAMP con kit commerciale sviluppato da IPADLAB (metodo 3). Per ciascun protocollo, la validazione è stata effettuata attraverso la definizione dei seguenti parametri: sensibilità analitica (limite di rilevabilità), specificità analitica, sensibilità e specificità diagnostica, accuratezza, ripetibilità e riproducibilità. Per l’ottenimento del valore della riproducibilità, ogni protocollo è stato sottoposto ad un ring test a cui hanno preso parte 15 laboratori afferenti ai servizi fitosanitari regionali (11) e ad Enti/Istituzioni di ricerca (4). Le prove effettuate con campioni di riferimento target e non-target hanno evidenziato una maggiore sensibilità analitica dei due metodi qPCR rispetto al metodo LAMP. La valutazione della specificità analitica ha evidenziato per tutti i protocolli una reazione generica nei confronti di fitoplasmi del gruppo 16SrV ed in nessun caso specifica verso i soli fitoplasmi agenti di FD. Complessivamente, i parametri di performance del metodo 1 sono risultati superiori rispetto agli altri metodi valutati, con valori di sensibilità e specificità diagnostica, accuratezza, ripetibilità e riproducibilità sempre superiori al 90%. I metodi 2 e 3, invece, hanno evidenziato, rispettivamente, bassi valori di specificità diagnostica (73,3%) e sensibilità diagnostica (75%).
Ferretti, L., Vizzaccaro, L., Bianchi, G., Mason, G., Rizzo, D., Calvi, M., et al. (2017). Validazione di protocolli per la diagnosi dei fitoplasmi agenti della flavescenza dorata della vite: risultati dal progetto nazionale ‘ASPROPI’.
Validazione di protocolli per la diagnosi dei fitoplasmi agenti della flavescenza dorata della vite: risultati dal progetto nazionale ‘ASPROPI’
A. Bertaccini;
2017
Abstract
La validazione dei protocolli di diagnosi secondo standard europei (ISO/IEC standard 16140:2003 e 17025:2005; EPPO standard PM7/76-4 e PM7/98-2), rappresenta un aspetto di fondamentale importanza nell’ambito della diagnosi fitopatologica. L’uso di protocolli validati è, infatti, alla base di un’efficiente applicazione delle misure fitosanitarie, garantendo una maggiore affidabilità dei risultati diagnostici ottenuti e la loro confrontabilità, quando prodotti in laboratori diversi ed in diverse condizioni operative. Negli ultimi anni, diversi progetti a livello europeo (Euphresco-FRUITPHYTOINTERLAB, -GRAFDEPI, -GRAFDEPI2) e nazionale (ARON-ARNADIA) hanno riguardato la validazione di protocolli per la diagnosi di patogeni vegetali. Il Progetto Finalizzato ASPROPI, recentemente finanziato dal MiPAAF, ha costituito la naturale prosecuzione dell’attività già svolta nell’ambito del progetto ARON-ARNADIA, avente come obiettivo quello di fornire linee guida per il rilevamento e l’identificazione di patogeni delle piante (funghi, batteri, fitoplasmi, virus e viroidi) ai laboratori preposti alla diagnosi degli organismi di qualità e/o quarantena, presenti sul territorio italiano. Con riferimento ai fitoplasmi, il progetto ha riguardato la validazione di protocolli per la diagnosi dei fitoplasmi agenti della flavescenza dorata (FD) della vite. La scelta delle metodologie diagnostiche da validare e la definizione dei parametri di validazione è scaturita dal lavoro congiunto di un Gruppo di lavoro di esperti costituito da varie istituzioni scientifiche di comprovata esperienza nello studio di tale patogeno. Complessivamente sono stati validati 3 protocolli molecolari, includenti: i) due protocolli TaqMan® real time PCR (qPCR) per la diagnosi multipla di FD, legno nero (LN) ed un controllo endogeno di cui, uno con kit commerciale sviluppato da IPADLAB (metodo 1) ed uno secondo la procedura descritta in Angelini et al. (2007) (metodo 2) e ii) un protocollo basato su tecnica LAMP con kit commerciale sviluppato da IPADLAB (metodo 3). Per ciascun protocollo, la validazione è stata effettuata attraverso la definizione dei seguenti parametri: sensibilità analitica (limite di rilevabilità), specificità analitica, sensibilità e specificità diagnostica, accuratezza, ripetibilità e riproducibilità. Per l’ottenimento del valore della riproducibilità, ogni protocollo è stato sottoposto ad un ring test a cui hanno preso parte 15 laboratori afferenti ai servizi fitosanitari regionali (11) e ad Enti/Istituzioni di ricerca (4). Le prove effettuate con campioni di riferimento target e non-target hanno evidenziato una maggiore sensibilità analitica dei due metodi qPCR rispetto al metodo LAMP. La valutazione della specificità analitica ha evidenziato per tutti i protocolli una reazione generica nei confronti di fitoplasmi del gruppo 16SrV ed in nessun caso specifica verso i soli fitoplasmi agenti di FD. Complessivamente, i parametri di performance del metodo 1 sono risultati superiori rispetto agli altri metodi valutati, con valori di sensibilità e specificità diagnostica, accuratezza, ripetibilità e riproducibilità sempre superiori al 90%. I metodi 2 e 3, invece, hanno evidenziato, rispettivamente, bassi valori di specificità diagnostica (73,3%) e sensibilità diagnostica (75%).I documenti in IRIS sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.
