Metodi a confronto per la diagnosi sierologica di Herpesvirus 1 in bufali del sud Italia

SUMMARY The purpose of the present study was to evaluate the accuracy of 4 commercial ELISA and serum neutralization test using buffaloes sera. Serological kits of pharmaceutical companies IN3 dignostic, IDEXX, and serum neutralization tests against anti-BoHV-1 and anti-BuHV-1 antibodies were used. 194 buffalo sera were collected from 16 dairy herds of the Caserta province. A statistical analysis of the comparison was made through the Cohen K test. The test Eradikit BuHV-1 IN3 diagnostic was the most suitable to make a diagnosis of infection BuHV-1 in buffaloes.

INTRODUZIONE Bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) e Bubaline herpesvirus type 1 (BuHV-1) appartengono entrambi alla sottofamiglia degli α-herpesvirinae. Tali virus, pur essendo altamente correlati tra di loro, si classificano come patogeni diversi (3). Essi inducono patologie a carico dell’apparato riproduttore e respiratorio e il contagio avviene per via orizzontale e verticale. Le specie animali di interesse zootecnico sensibili all’infezione eterologa da herpesvirus tipo 1 sono due: Bubalus bubalis (bufalo mediterraneo italiano) e Bos taurus (bovino domestico) (4,5). In letteratura è noto che i virus erpetici 1 inducono nella specie bovina una sintomatologia clinica conclamata, diversamente nella specie bufalina è quasi sempre subclinica. Sono patogeni capaci di stabilire latenza nei gangli craniali (trigeminali) e/o sacrali, e questo meccanismo consente loro di persistere nell’animale con infezione silente e potersi poi riattivare in condizioni di stress. Nel presente contributo è stato condotto uno studio preliminare di confronto tra metodi diagnostici sierologici per la ricerca di anticorpi anti-herpesvirus 1 nei bufali (1,3). Gli scopi principali sono stati: 1 - confrontare i risultati ottenuti, dall’analisi di sieri bufalini, con l’utilizzo di kit ELISA indiretti presenti in commercio e prove di sieroneutralizzazione (SN); 2 – valutare, nei sieri di bufalo, la capacità discriminante sia delle prove immunoenzimatiche che della SN nei confronti di anticorpi anti-BoHV-1 e anti-BuHV-1. MATERIALI E METODI Durante il periodo gennaio 2014 e maggio 2016 sono state campionate 16 aziende bufaline (ad indirizzo produttivo latte) i cui proprietari avevano dato il consenso informato a poter eseguire prelievi di sangue. E’ stato effettuato un campionamento “di convenienza” nella provincia di Caserta e sono stati raccolti complessivamente 194 sieri di bufalo. Tutte le aziende testate non avevano mai effettuato trattamenti vaccinali nei confronti del virus erpetico. Tutti i sieri sono stati esaminati con i seguenti kit diagnostici ELISA: 1) IDEXX IBR gB X3 test; 2) IDEXX IBR gE Ab test; 3) Eradikit BuHV-1 IN3 diagnostic (Cod. 2848-2); 4) Eradikit Discrimination BoHV-1/BuHV-1 IN3 diagnostic (Cod. 2628-2). Sono state inoltre effettuate su tutti i sieri prove di SN comparativa, utilizzando il ceppo Cooper BoHV-1 e il ceppo Metzler BuHV-1 per la ricerca di anticorpi specifici. RUSULTATI E DISCUSSIONE La Tabella 1 illustra gli esiti dei 194 sieri bufalini esaminati. In dettaglio, i risultati ottenuti tramite l’utilizzo dei kit della ditta IDEXX sono stati i seguenti: 20 animali (10,31%) sono risultati negativi, 147 animali (75,77%) sono risultati positivi al BoHV-1 (profilo reattivo gB+/gE+), 27 (13,92%) al BuHV-1 (profilo reattivo gB+/gE-). In merito al test Eradikit Discrimination BoHV-1/BuHV-1 della ditta IN3 diagnostic, 25 animali (12,9%) sono risultati positivi a BoHV-1, 134 (69,07%) positivi al BuHV-1, 22 (11,34%) coinfetti, 13 (6,70%) non caratterizzati. I risultati ottenuti mediante l’utilizzo del kit ELISA indiretto Eradikit BuHV-1 IN3 diagnostic sono stati i seguenti: 20 (10,31%) negativi, 174 (89,69%) positivi a BuHV-1. Infine la prova di SN ha fornito i seguenti esiti: 179 (92,27%) campioni risultarono positivi a herpesvirus 1, e 15 (7,73%) negativi. E’ stato osservato che la prova di cross-SN ha mostrato una capacità discriminante verso il ceppo omologo di almeno 2 diluizioni in 125 animali, dei quali 50 (40%) risultavano infetti a BoHV-1 e 75 (60%) infetti a BuHV-1. Questi ultimi dati non hanno confermato quanto dichiarato in studi precedenti, nei quali gli autori hanno riferito che nel bufalo la prova di virus neutralizzazione non presentava alcun potere discriminante (2,6,7), dato che non risultava essere in grado di differenziare, in caso di positività, anticorpi evocati dal ceppo BuHV-1 piuttosto che dal ceppo BoHV-1 (3). Nella Tabella 2 si illustra il grado di accordo tra i test diagnostici, calcolato tramite il test K di Cohen. L’analisi statistica indica un accordo buono, valore di k = 0.781, quando sono stati confrontati i risultati del kit ELISA indiretto Eradikit BuHV-1 IN3 diagnostic (G) con quelli della prova cross-SN che utilizzava il ceppo BuHV-1 (E). Un accordo modesto (K tra 0.254 e 0.403) è stato riscontrato dal confronto dei seguenti kit: IN3 Eradikit Discrimination BuHV-1 (F) con il test SN con ceppo BuHV-1 (E), IN3 Eradikit Discrimination BuHV-1 (F) con il kit IN3 Eradikit BuHV-1 (G) e il kit IDEXX (profilo reattivo gB+/gE+) (A) con la prova SN con ceppo BoHV-1 (B). In conclusione, sebbene lo studio abbia riguardato solo 16 allevamenti bufalini, il numero di animali testati è stato sufficiente per poter concludere che il test Eradikit BuHV-1 IN3 diagnostic è il più adatto da utilizzare se desideriamo effettuare una diagnosi di infezione da BuHV-1 in bufali tramite un test ELISA specifico, veloce e di facile esecuzione. Sulla base dei nostri risultati i campioni individuati “non caratterizzati”, con il kit Eradikit Discrimination BoHV-1/BuHV-1 IN3 diagnostic e risultati come negativi alla prova cross-SN con entrambi i ceppi BoHV-1 e BuHV-1, potrebbero essere categorizzati come negativi. Infatti si tratta di campioni con valori di densità ottica (OD) non validi, ovvero con valori al di sotto della soglia minima richiesta per la caratterizzazione del ceppo virale in esame.