NUOVI APPROCCI PER L’IDENTIFICAZIONE DI SPECIE DI LATTOBACILLI: RUOLO DELLA SPETTROMETRIA DI MASSA MALDI-TOF E DELLA METABOLOMICA

I lattobacilli rappresentano un vasto genere di microrganismi che colonizzano diverse sedi dell’organismo umano, dove svolgono un ruolo chiave nel mantenimento dell’omeostasi microbica. Sebbene il loro ruolo come microrganismi ‘health-promoting’ sia ben riconosciuto, la loro identificazione a livello di specie pone ancora numerose difficoltà e si basa sulla combinazione di approcci fenotipici e genotipici. Scopo del presente studio è stato quello di comparare diverse metodiche per l’identificazione specie-specifica di 40 ceppi di lattobacilli isolati da campioni clinici (tamponi vaginali/orali, feci) o presenti in formulazioni di probiotici. In particolare, il classico approccio basato sul sequenziamento del gene 16s rRNA è stato confrontato con un’analisi proteomica ribosomale mediante spettrometria di massa MALDI-TOF e con lo studio dei metaboliti batterici tramite spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (1H-RMN). Il sequenziamento del gene 16s rRNA ha portato alle seguenti identificazioni: 7 L. crispatus, 7 L. gasseri, 5 L. acidophilus, 5 L. delbrueckii, 2 L. vaginalis, 2 L. reuteri, 6 L. plantarum, 1 L. pentosus, 2 L. rhamnosus, 2 L. casei/paracasei e 1 L. brevis. Il relativo albero filogenetico è stato costruito mediante software MEGA. L’analisi spettrometrica è stata condotta dopo estrazione proteica con acido formico/acetonitrile a partire da un pellet batterico di 6x109 cfu. I campioni sono stati analizzati con lo strumento Bruker MicroFlex MALDI-TOF MS e l’identificazione di specie è stata ottenuta confrontando lo spettro proteico con un database dedicato. Inoltre, a partire dallo spettro medio di ogni ceppo batterico, è stato costruito un dendrogramma, tramite il software Biotyper 3.1. L’analisi metabolica in 1H-RMN è stata eseguita con lo spettrometro AVANCE III (Bruker) sia sull’intero set di metaboliti intracellulari, dopo opportuna lisi batterica, sia sul gruppo di metaboliti extracellulari, a seguito di una crescita batterica di 18-24 ore in brodo MRS. La spettrometria di massa MALDI-TOF si è dimostrata altamente affidabile nell’identificazione specie-specifica dei diversi lattobacilli, come dimostrato dall’assoluta sovrapponibilità del dendrogramma proteomico con quello genomico basato sul gene 16s rRNA. L’analisi metabolomica invece non ha consentito un raggruppamento filogenetico delle varie specie, ma ha permesso di identificare metaboliti marker caratteristici, che potrebbero chiarire i meccanismi che stanno alla base dell’effetto protettivo svolto da alcune specie.