Produzione di monossido di azoto in cellule progenitrici endoteliali derivate da sangue periferico e cordonale

L’interesse destato dalle cellule progenitrici endoteliali (EPCs) in campo medico risiede nella loro utilità come biomarkers per valutare il rischio di malattie cardiovascolari, nonchè nella loro capacità di partecipare alla neovasculogenesi di aree colpite da insulto ischemico, compreso il tessuto miocardico. Dato il ruolo centrale rivestito dall’ossido nitrico (NO) nel processo angiogenetico e vasculogenetico, secondo la via VEGF-eNOS-NO ampiamente studiata nelle cellule endoteliali mature, scopo della presente ricerca è stato quello di valutare la presenza di tale mediatore e degli enzimi deputati alla sua sintesi (NOS) nelle EPCs. Il sangue proveniente da sacche di buffy coat di soggetti adulti e da sacche di sangue cordonale fresco è stato centrifugato su gradiente di densità per ottenerne la componente mononucleata. Quest’ultima è stata seminata in toto alla concentrazione di 106cellule/ml su supporti ricoperti da fibronectina, in presenza di VEGF , FGF-b e IGF-I 2. La componente cellulare mononucleata del sangue, sia cordonale che periferico, è stata coltivata in toto per tre settimane nelle condizioni differenziative già descritte. Nella progenie cellulare così ottenuta la produzione di NO è stata evidenziata tramite microscopia a fluorescenza utilizzando la sonda DAF2-DA. Nonostante la presenza di una certa quantità di NO riscontrata già dopo la prima settimana di coltura, i livelli delle diverse isoforme di NOS sono risultati non evidenziabili a livello proteico tramite Western Blotting. Anche la quantificazione delle NOS a livello trascrizionale ha confermato livelli di eNOS mRNA di gran lunga inferiori rispetto alle cellule endoteliali mature (HUVECs) sia nelle EPCs di origine cordonale che periferica. Analogamente i livelli di mRNA codificante nNOS, non riscontrabili nella popolazione di MNCs di partenza, sono risultati notevolmente inferiori rispetto alle HUVECs, mostrando un lieve aumento dopo 2 settimane di coltura in entrambe le popolazioni di EPCs. Contrariamente a quanto riscontrato per le isoforme di NOS costitutive la quantità di mRNA codificante per iNOS è risultata del tutto paragonabile a quella delle HUVECs. L-NAME si è rivelato un inibitore piuttosto efficace per il processo angiogenetico delle HUVECs simulato su Matrigel e riduce la fluorescenza DAF-2-NO dipendente in modo evidenziabile al microscopio a fluorescenza. Mentre l’effetto dell’inibizione di eNOS da parte di L-NIO, valutato spettrofotometricamente, non si discosta né nelle EPCs derivate da sangue adulto nè in quelle di origine cordonale da L-NAME, negli angioblasti di origine periferica L-NIL risulta più efficace di L-NAME, diminuendo la produzione di NO. Quest’ultimo risultato confermerebbe il ruolo preminente svolto dalla iNOS in tale popolazione risultando in accordo coi più elevati livelli trascrizionali di iNOS mRNA riscontrati tramite real time RT-PCR. In conclusione il trattamento in vitro delle MNCs di sangue cordonale e periferico con terreni di coltura supplementati con VEGF ed altri fattori di crescita angiogenetici, al fine di ottenere il loro differenziamento in EPCs, non è sufficiente a stimolare l’espressione della eNOS a livelli paragonabili a quelli delle cellule endoteliali mature. Nelle EPCs la sintesi in vitro di NO pare principalmente sostenuta dalla iNOS, la cui espressione è maggiore nelle EPCs provenienti da sangue adulto periferico. Quest’ultimo dato suggerisce che la sintesi di iNOS venga maggiormente indotta in tali cellule per controbilanciare la minore produzione di NO da parte delle NOS costitutive.