Il GATA- 4 è un membro della famiglia dei fattori di trascrizione GATA; queste proteine leganti il DNA hanno ruoli importanti nella regolazione del differenziamento, proliferazione e morfogenesi degli organi durante l’embriogenesi e la vita adulta. Sono stati identificati sei membri della famiglia GATA nei vertebrati e queste proteine nucleari regolano la trascrizione attraverso un legame alla sequenza consenso 5’ –WGATAR-3’ presente nei promotori dei target genetici; tre membri di questa famiglia, GATA 4/5/6, sono espressi nell’embriogenesi del cuore. Inoltre sia GATA- 4 che GATA- 6 sono espressi nel cuore adulto e presumibilmente regolano il fenotipo differenziato dei cardiomiociti. Il presente studio e' stato finalazzato alla ricerca dell’RNA messaggero del GATA- 4 in cardiomioblasti H9c2, una linea di cellule muscolari cardiache di ventricolo di embrione di ratto. Una volta isolato l’RNA, è stata eseguita la retrotrascrizione in cDNA usando il Transcriptor First Strand cDNA Sinthesis Kit, Roche Diagnostics. E’stata poi condotta una reazione di polimerizzazione a catena (PCR) attraverso una Real Time PCR, Light Cycler, Roche Diagnostics, che ha permesso di amplificare un segmento di DNA che si trova tra due regioni di sequenza nota e usando come punto di partenza della DNA polimerasi due oligonucleotidi, detti primer, complementari a due sequenze che fiancheggiano il segmento da amplificare. La tecnologia utilizzata è quella delle sonde TaqMan che, degradate durante la fase di amplificazione, rilasciano un fluoroforo rilevato in “tempo reale” dallo strumento. Il numero di cicli, o crossing point (CP), in cui inizia l’amplificazione dei campioni è l’indice quantitativo a cui ci si riferisce. La fluorescenza emessa dai campioni nel corso della reazione di amplificazione e' stata rappresentata da due curve ottenute utilizzando lo stesso campione e che sono quindi indicative del grado di riproducibilità della misura. Allo scopo di verificare se l’amplificazione è avvenuta in modo corretto nei riguardi dell’espressione del gene target del GATA – 4, si è provveduto a verificare, mediante elettroforesi su gel di agarosio, la presenza del DNA amplificato. Il dosaggio dell’RNA messaggero del GATA- 4 e dell’espressione delle proteine, può quindi fornire utili informazioni sia nelle ricerche nelle quali sono studiati i processi di differenziamento delle cellule staminali in cardiomiociti, sia per verificare nei cardiomiociti adulti il ruolo di questo fattore di trascrizione nei processi di sopravvivenza cellulare.
Valutazione dell'espressione dell'RNA messaggero del fattore di trascrizione GATA-4 in cellule H9c2
CARBONI, MARCO;BONAVITA, FRANCESCA;BONAFÈ, FRANCESCA;GUARNIERI, CARLO
2006
Abstract
Il GATA- 4 è un membro della famiglia dei fattori di trascrizione GATA; queste proteine leganti il DNA hanno ruoli importanti nella regolazione del differenziamento, proliferazione e morfogenesi degli organi durante l’embriogenesi e la vita adulta. Sono stati identificati sei membri della famiglia GATA nei vertebrati e queste proteine nucleari regolano la trascrizione attraverso un legame alla sequenza consenso 5’ –WGATAR-3’ presente nei promotori dei target genetici; tre membri di questa famiglia, GATA 4/5/6, sono espressi nell’embriogenesi del cuore. Inoltre sia GATA- 4 che GATA- 6 sono espressi nel cuore adulto e presumibilmente regolano il fenotipo differenziato dei cardiomiociti. Il presente studio e' stato finalazzato alla ricerca dell’RNA messaggero del GATA- 4 in cardiomioblasti H9c2, una linea di cellule muscolari cardiache di ventricolo di embrione di ratto. Una volta isolato l’RNA, è stata eseguita la retrotrascrizione in cDNA usando il Transcriptor First Strand cDNA Sinthesis Kit, Roche Diagnostics. E’stata poi condotta una reazione di polimerizzazione a catena (PCR) attraverso una Real Time PCR, Light Cycler, Roche Diagnostics, che ha permesso di amplificare un segmento di DNA che si trova tra due regioni di sequenza nota e usando come punto di partenza della DNA polimerasi due oligonucleotidi, detti primer, complementari a due sequenze che fiancheggiano il segmento da amplificare. La tecnologia utilizzata è quella delle sonde TaqMan che, degradate durante la fase di amplificazione, rilasciano un fluoroforo rilevato in “tempo reale” dallo strumento. Il numero di cicli, o crossing point (CP), in cui inizia l’amplificazione dei campioni è l’indice quantitativo a cui ci si riferisce. La fluorescenza emessa dai campioni nel corso della reazione di amplificazione e' stata rappresentata da due curve ottenute utilizzando lo stesso campione e che sono quindi indicative del grado di riproducibilità della misura. Allo scopo di verificare se l’amplificazione è avvenuta in modo corretto nei riguardi dell’espressione del gene target del GATA – 4, si è provveduto a verificare, mediante elettroforesi su gel di agarosio, la presenza del DNA amplificato. Il dosaggio dell’RNA messaggero del GATA- 4 e dell’espressione delle proteine, può quindi fornire utili informazioni sia nelle ricerche nelle quali sono studiati i processi di differenziamento delle cellule staminali in cardiomiociti, sia per verificare nei cardiomiociti adulti il ruolo di questo fattore di trascrizione nei processi di sopravvivenza cellulare.I documenti in IRIS sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.
