Valutazione dell'espressione dell'RNA messaggero del fattore di trascrizione GATA-4 in cellule H9c2

Il GATA- 4 è un membro della famiglia dei fattori di trascrizione GATA; queste proteine leganti il DNA hanno ruoli importanti nella regolazione del differenziamento, proliferazione e morfogenesi degli organi durante l’embriogenesi e la vita adulta. Sono stati identificati sei membri della famiglia GATA nei vertebrati e queste proteine nucleari regolano la trascrizione attraverso un legame alla sequenza consenso 5’ –WGATAR-3’ presente nei promotori dei target genetici; tre membri di questa famiglia, GATA 4/5/6, sono espressi nell’embriogenesi del cuore. Inoltre sia GATA- 4 che GATA- 6 sono espressi nel cuore adulto e presumibilmente regolano il fenotipo differenziato dei cardiomiociti. Il presente studio e' stato finalazzato alla ricerca dell’RNA messaggero del GATA- 4 in cardiomioblasti H9c2, una linea di cellule muscolari cardiache di ventricolo di embrione di ratto. Una volta isolato l’RNA, è stata eseguita la retrotrascrizione in cDNA usando il Transcriptor First Strand cDNA Sinthesis Kit, Roche Diagnostics. E’stata poi condotta una reazione di polimerizzazione a catena (PCR) attraverso una Real Time PCR, Light Cycler, Roche Diagnostics, che ha permesso di amplificare un segmento di DNA che si trova tra due regioni di sequenza nota e usando come punto di partenza della DNA polimerasi due oligonucleotidi, detti primer, complementari a due sequenze che fiancheggiano il segmento da amplificare. La tecnologia utilizzata è quella delle sonde TaqMan che, degradate durante la fase di amplificazione, rilasciano un fluoroforo rilevato in “tempo reale” dallo strumento. Il numero di cicli, o crossing point (CP), in cui inizia l’amplificazione dei campioni è l’indice quantitativo a cui ci si riferisce. La fluorescenza emessa dai campioni nel corso della reazione di amplificazione e' stata rappresentata da due curve ottenute utilizzando lo stesso campione e che sono quindi indicative del grado di riproducibilità della misura. Allo scopo di verificare se l’amplificazione è avvenuta in modo corretto nei riguardi dell’espressione del gene target del GATA – 4, si è provveduto a verificare, mediante elettroforesi su gel di agarosio, la presenza del DNA amplificato. Il dosaggio dell’RNA messaggero del GATA- 4 e dell’espressione delle proteine, può quindi fornire utili informazioni sia nelle ricerche nelle quali sono studiati i processi di differenziamento delle cellule staminali in cardiomiociti, sia per verificare nei cardiomiociti adulti il ruolo di questo fattore di trascrizione nei processi di sopravvivenza cellulare.