Messa a punto di un metodo di quantificazione assoluta dell’mRNA di un panel citochinico e sua applicazione in corso di infezione da Photobacterium damselae subsp. piscicida.

Un metodo di quantificazione assoluta in Real Time PCR per l’analisi dell’espressione genica di 3 citochine del branzino (Dicentrarchus labrax) è stato sviluppato e applicato in corso di infezione sperimentale con Photobacterium damselae subsp. piscicida (Phdp). Al fine di effettuare una quantificazione assoluta è stato utilizzato il metodo della curva standard; questo metodo permette di esprimere i risultati della quantificazione come copie di cDNA per l. Per ogni citochina del branzino IL-1, IL-6 e IL-8 è stato selezionato un frammento specifico, così come per l’RNA 18S del branzino da utilizzare come housekeeping per la normalizzazione dei risultati. Le curve standard sono state allestite utilizzando del DNA plasmidico ottenuto inserendo il frammento specifico in un vettore plasmidico (pCR 4-TOPO Vector). I plasmidi ottenuti sono stati linearizzati e quantificati al fine di creare standard di riferimento robusti e stabili per studi a lungo termine. La Real Time PCR è stata allestita con la chimica SYBR Green I utilizzando il sistema 7300 Real Time PCR (Applied Biosystem). Dopo ogni reazione è stata analizzata la curva di dissociazione del prodotto per verificarne la specificità. La sensibilità della metodica è stata valutata testando diluizioni seriali del plasmide. Al fine di applicare la metodica allo studio della risposta immunitaria in corso di infezione sperimentale da Phdp branzini di 5 g sono stati acclimatati e quindi campionati ad intervalli di tempo per verificare il livello basale di espressione citochinica dei soggetti in condizioni normo-fisiologiche. Successivamente i soggetti sono stati sottoposti a challenge con il ceppo 213/ITT di Phdp gentilmente fornito dal Dr. Manfrin dell’IZS delle Venezie. L’infezione sperimentale è stata effettuata su soggetti di circa 50 g tramite iniezione intraperitoneale di 100 l di una sospensione contenente 1,9x107ufc/ml. Il rene e la milza di 3 soggetti sono stati prelevati 24 e 72 ore post-infezione e conservati per l’estrazione dell’RNA. Per ciascuna citochina è stato ottenuto un plasmide con un numero di copie/µl compreso fra 0,3 e 2,4x109. L’analisi della curva di dissociazione ha confermato la specificità di reazione mostrando la presenza di un singolo picco. Il limite di sensibilità per il rilevamento dei geni citochinici è risultato rispettivamente di 2,4 x101, 1,8 x101, 1,6 x101 e 0,3 x101 copie/µl per IL-1, IL-6, IL-8 e 18S. Tutte le corse effettuate hanno dato valori di R2≥0,99 e una efficienza di 1.00  0.20. Le prove di ripetibilità intra-assay hanno dato valori compresi fra ≤0,5 e ≤0,9 Std Dev Ct per tutte le citochine mostrando una elevate riproducibilità della prova. Il metodo messo a punto si è quindi mostrato sensibile, riproducibile ed accurato per la quantificazione dei livelli di mRNA delle 3 citochine analizzate nel branzino. I soggetti in condizioni normo-fisiologiche hanno mostrato valori assoluti medi di 2,4 x102, 7,4 x101 e 1,2 x103 copie/µl nella milza e di 6,4x101, 1,5x101 e 4x102 copie/µl nel rene rispettivamente per IL-1β, IL-6 e IL-8. I valori citochinici sono stati monitorati attraverso 5 campionamenti effettuati durante 39 giorni di osservazione, tali valori non hanno mostrato differenze statisticamente significative durante tale periodo, evidenziando una elevata stabilità dei valori citochinici che indica l’assenza di fattori interferenti nel processo di stabulazione. Nei soggetti sottoposti a challenge è stata invece evidenziata una elevata sovra espressione dei livelli di tutte 3 le citochine con un incremento minimo di 1 logaritmo sia nel rene che nella milza 24h post infezione. I dati a 72h p.i. mostrato un lieve decremento dei valori di tutte e tre le citochine anche se con differente cinetica. Lo studio effettuato ha permesso quindi di monitorare l’andamento di 3 importanti citochine pro-infiammatorie in corso di infezione da Phdp, apportando importanti informazioni pro...