Caratterizzazione molecolare di ceppi di coronavirus felini ed analisi filogenetica comparativa

Obiettivo del presente progetto è quello di approfondire le conoscenze relative alle coronavirosi feline sia da un punto di vista virologico che da quello immunopatogenetico, per trarre informazioni utili sia per il controllo della diffusione dei coronavirus felini (FCoV) nelle popolazioni feline, sia per prevenire possibili zoonosi: da un lato, infatti, l'instabilità genetica dei CoV può essere responsabile di mutazioni o ricombinazioni responsabili di salti di specie, come accaduto nella recente epidemia di SARS; dall'altro, il sistema immunitario può determinare persistenza del virus nella popolazione favorendo così la comparsa di nuove varianti virali, potenzialmente patogene anche per l'uomo. Per raggiungere tale obiettivo si procederà al campionamento di sangue, feci e tessuti da: - gatti di allevamento, dove sono frequenti i portatori di FCoV e dove è possibile identificare in base al tipo di eliminazione fecale i gatti più o meno resistenti all'infezione - gatti clinicamente sani di proprietà FCoV-negativii - gatti con peritonite infettiva felina, la forma clinicamente manifesta di coronavirosi, che presentano varianti patogene di FCoV e/o stati immunitari in grado di determinare lo sviluppo della malattia I campioni di feci o tessuti verranno utilizzati per indagare i seguenti aspetti virologici: - identificazione, mediante sequenziamento ed analisi bioinformatica, delle caratteristiche genomiche dei ceppi di FCoVs identificati nei portatori sani e malati, comparandole con dati reperibili in letteratura e relativi ad altri coronavirus animali ed umani allo scopo di comprendere i meccanismi evolutivi e patogenetici dei FCoV. - Identifcazione delle quasispecie virali mediante analisi della variabilità di sequenza a carico dei geni S, 7b e 3c mediante SSCP (single strand conformational polymorphism) - Predizione degli epitopi immunostimolanti nella sequenza della nucleoproteina N dei FCoV attraverso analisi bioinformatiche e verifica in vitro di proteine ricombinanti prodotte sulla base delle sequenze identificate - Messa a punto di sistemi di isolamento in coltura cellulare dei ceppi di FCoVs "di campo" Sui campioni di sangue e tessuti verranno invece approfonditi i seguenti aspetti immunopatologici: - Identificazione di quadri clinico-patologici associati alle diverse forme di infezione da FCoV (peritonite infettiva felina o infezione asintomatica con eliminazione transitoria, persistente o intermittente) - Identificazione della risposta immunitaria innata (livelli e grado di sialilazione dell'alfa-1-glicoproteina acida) o specifica (quantificazione delle citochine prodotte da specifiche popolazioni cellulari) in gatti con diverse forme di infezione da FCoV. - Caratterizzazione della risposta citochinica in linee cellulari immunocompetenti feline prelevate da gatti FCoV negativi ma stimolate con ceppi virali dalle caratteristiche molecolari note (vedi sopra), con le proteine immunogene di FCoV prodotte nel corso del progetto, o con campioni biologici prelevati da gatti FCoV-infetti - Isolamento e sequenziamento di TLR3, TLR7 e TLR8 felini, probabilmente coinvolti in questo tipo di risposte ma dei quali non sono disponibili informazioni in letteratura: una volta caratterizzati i TLR, verrà valutato il loro eventuale polimorfismo genetico e quantificata la loro espressione in specifiche popolazioni cellulari di soggetti sani e sintomatici L'approccio sopra descritto consentirà di raccogliere una serie di dati sul virus e sulle risposte immunitarie in presenza di FCoV. Tali dati verranno integrati tra loro per valutare sia l'epidemiologia molecolare dei FCoV, sia l'influenza dei vari ceppi virali nel determinare le risposte immunitarie o, al contrario, l'esistenza di risposte immunitarie in grado di influenzare l'evoluzione delle quasispecie virali.