I bisfosfonati (BP) sono una classe di farmaci in grado di legarsi all'idrossiapatite dell'osso. Essi si localizzano perciò nelle aree di attivo rimodellamento, ove esercitano attività antiosteolitica. Per questa loro proprietà intrinseca, sono correntemente impiegati nel trattamento di malattie caratterizzate da aumentato riassorbimento osseo, come l'osteoporosi e il morbo di Paget. Inoltre, è stato dimostrato che essi inducono effetti proapoptotici e antiangiogenici, che ne possono aumentare l'efficacia nell'osteolisi secondaria a neoplasie. Una recente importante applicazione dei BP, che sfrutta la loro affinità all'idrossiapatite, è l'impiego come veicolo per il trasporto di farmaci per terapie mirate all'osso, allo scopo di somministrare il principio attivo solo nel tessuto malato, limitando l'esposizione dell'organismo in toto all'azione di specie esogene che potrebbero provocare effetti indesiderati o addirittura nocivi. Questa proprietà viene in particolare sfruttata per il trasporto mirato alle aree osteolitiche di radioisotopi per diagnostica, nonchè di agenti antitumorali per il trattamento delle metastasi ossee. Ci si propone di eseguire la valutazione biologica in vitro dei BP sintetizzati nel corso del progetto. In particolare, saranno verificate la citotossicità e l'attività antiosteoclastica. Sarà inoltre valutato che i chemioterapici coniugati con i BP conservino la capacità di inibire la proliferazione di cellule neoplastiche. Nella fase iniziale del progetto saranno standardizzate le condizioni sperimentali e caratterizzati i modelli cellulari. La citotossicità sarà determinata su colture continue di fibroblasti (linee cellulari L929 e MRC-5). L'attività antiosteoclastica sarà valutata su osteoclasti umani ottenuti a partire da monociti del sangue periferico. I monociti isolati saranno mantenuti in condizioni differenzianti, in presenza di RANKL e M-CSF, per 7-10 giorni, al termine dei quali le colture saranno caratterizzate per la formazione di cellule multinucleate (MNC) e per l'espressione citochimica di fosfatasi acida-tartrato resistente (TRACP). Il fenotipo osteoclastico sarà dimostrato anche tramite il dosaggio nel sopranatante di TRACP5b e la determinazione della degradazione del collagene osseo umano di Tipo I. Nella fase successiva del progetto saranno verificate la tossicità e l'attività biologica dei substrati di base (vinilbisfosfonato e altri BP) tramite l'impiego dei modelli di colture cellulari. Infatti i substrati che verranno utilizzati per la sintesi dei nuovi BP sono noti dal punto di vista della caratterizzazione chimica, ma non altrettanto per quanto riguarda l'attività biologica. La citotossicità sarà valutata tramite i tests dell'MTT e del rosso neutro sulle colture dei fibroblasti. L'attività anti-osteoclastica verrà determinata tramite saggi di inibizione della formazione di MNC TRACP-positive e della degradazione del collagene di Tipo I. Nella terza fase del progetto, sarà saggiata la citotossicità di diluizioni scalari dei BP sintetizzati dalle altre Unità, confrontandoli con i substrati di base. Sulla base dei risultati ottenuti saranno selezionate le molecole più idonee, che saranno poi sottoposte a prove per stabilirne la capacità di inibire la formazione di MNC TRACP-positive e la degradazione del collagene di Tipo I. La capacità di inibire il riassorbimento osseo verrà anche determinata tramite saggio su sezioni di dentina: gli osteoclasti verranno seminati sulla dentina e quindi trattati con i BP. Il numero e la dimensione delle lacune di riassorbimento verranno valutate dopo colorazione con leptina coniugata a perossidasi, e tramite l'impiego di analisi di immagine. Inoltre sarà determinato il numero di MNC in apoptosi dopo colorazione con Hoechst 33258. Verrà infine verificato che il 5-fluoruracile (5-FU) e il Pt(II)abbiano conservato la loro capacità di inibire in vitro la proliferazione di cellule neoplastiche anche dopo la coniugazione con i ...
Valutazione biologica in vitro di nuove molecole bioattive a base di bisfosfonati, sintetizzate mediante strategie catalitiche innovative, per la diagnosi e la terapia di malattie osteolitiche / Giunti A.. - (2008).
Valutazione biologica in vitro di nuove molecole bioattive a base di bisfosfonati, sintetizzate mediante strategie catalitiche innovative, per la diagnosi e la terapia di malattie osteolitiche
GIUNTI, ARMANDO
2008
Abstract
I bisfosfonati (BP) sono una classe di farmaci in grado di legarsi all'idrossiapatite dell'osso. Essi si localizzano perciò nelle aree di attivo rimodellamento, ove esercitano attività antiosteolitica. Per questa loro proprietà intrinseca, sono correntemente impiegati nel trattamento di malattie caratterizzate da aumentato riassorbimento osseo, come l'osteoporosi e il morbo di Paget. Inoltre, è stato dimostrato che essi inducono effetti proapoptotici e antiangiogenici, che ne possono aumentare l'efficacia nell'osteolisi secondaria a neoplasie. Una recente importante applicazione dei BP, che sfrutta la loro affinità all'idrossiapatite, è l'impiego come veicolo per il trasporto di farmaci per terapie mirate all'osso, allo scopo di somministrare il principio attivo solo nel tessuto malato, limitando l'esposizione dell'organismo in toto all'azione di specie esogene che potrebbero provocare effetti indesiderati o addirittura nocivi. Questa proprietà viene in particolare sfruttata per il trasporto mirato alle aree osteolitiche di radioisotopi per diagnostica, nonchè di agenti antitumorali per il trattamento delle metastasi ossee. Ci si propone di eseguire la valutazione biologica in vitro dei BP sintetizzati nel corso del progetto. In particolare, saranno verificate la citotossicità e l'attività antiosteoclastica. Sarà inoltre valutato che i chemioterapici coniugati con i BP conservino la capacità di inibire la proliferazione di cellule neoplastiche. Nella fase iniziale del progetto saranno standardizzate le condizioni sperimentali e caratterizzati i modelli cellulari. La citotossicità sarà determinata su colture continue di fibroblasti (linee cellulari L929 e MRC-5). L'attività antiosteoclastica sarà valutata su osteoclasti umani ottenuti a partire da monociti del sangue periferico. I monociti isolati saranno mantenuti in condizioni differenzianti, in presenza di RANKL e M-CSF, per 7-10 giorni, al termine dei quali le colture saranno caratterizzate per la formazione di cellule multinucleate (MNC) e per l'espressione citochimica di fosfatasi acida-tartrato resistente (TRACP). Il fenotipo osteoclastico sarà dimostrato anche tramite il dosaggio nel sopranatante di TRACP5b e la determinazione della degradazione del collagene osseo umano di Tipo I. Nella fase successiva del progetto saranno verificate la tossicità e l'attività biologica dei substrati di base (vinilbisfosfonato e altri BP) tramite l'impiego dei modelli di colture cellulari. Infatti i substrati che verranno utilizzati per la sintesi dei nuovi BP sono noti dal punto di vista della caratterizzazione chimica, ma non altrettanto per quanto riguarda l'attività biologica. La citotossicità sarà valutata tramite i tests dell'MTT e del rosso neutro sulle colture dei fibroblasti. L'attività anti-osteoclastica verrà determinata tramite saggi di inibizione della formazione di MNC TRACP-positive e della degradazione del collagene di Tipo I. Nella terza fase del progetto, sarà saggiata la citotossicità di diluizioni scalari dei BP sintetizzati dalle altre Unità, confrontandoli con i substrati di base. Sulla base dei risultati ottenuti saranno selezionate le molecole più idonee, che saranno poi sottoposte a prove per stabilirne la capacità di inibire la formazione di MNC TRACP-positive e la degradazione del collagene di Tipo I. La capacità di inibire il riassorbimento osseo verrà anche determinata tramite saggio su sezioni di dentina: gli osteoclasti verranno seminati sulla dentina e quindi trattati con i BP. Il numero e la dimensione delle lacune di riassorbimento verranno valutate dopo colorazione con leptina coniugata a perossidasi, e tramite l'impiego di analisi di immagine. Inoltre sarà determinato il numero di MNC in apoptosi dopo colorazione con Hoechst 33258. Verrà infine verificato che il 5-fluoruracile (5-FU) e il Pt(II)abbiano conservato la loro capacità di inibire in vitro la proliferazione di cellule neoplastiche anche dopo la coniugazione con i ...I documenti in IRIS sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.
