I Coronavirus felini (FCoVs) sono virus a RNA che colpiscono i felidi domestici e selvatici determinando una grave patologia la Peritonite Infettiva Felina (FIP). I virioni contengono 3 principali proteine strutturali: la proteina dello spike S, la proteina di membrana M e la proteina del nucleocapside N. Per altre specie di coronavirus, si è dimostrato il coinvolgimento della proteina N nella stimolazione di un’immunità proteggente. Considerato che nel caso dei FCoVs soltanto l’immunità cellulo-mediata previene lo sviluppo della malattia, nel presente lavoro è stata valutata la presenza di domini immuno-stimolanti in ceppi di FCoVs identificati in soggetti portatori sani e malati. Si è pertanto proceduto al sequenziamento dell'intero gene strutturale N, di circa 1130 bp, di 71 ceppi virali, in parte raccolti nell'ambito di screening effettuati presso oasi feline ed allevamenti ed in parte afferenti al dipartimento a scopo diagnostico. Le sequenze ottenute sono state sottoposte ad analisi bio-informatiche ai fini di identificare nel profilo antigenico differenze di rilievo tra ceppi virulenti ed avirulenti e di aumentare le conoscenze relative alla struttura ed organizzazione della proteina N. Le sequenze sono state allineate mediante il metodo ClustalW ed è stata effettuata la predizione dei siti antigenici mediante algoritmi specifici, implementati in diversi software, che utilizzano metodi diretti, quali l’algoritmo AMPHI, in grado di identificare sulla base della sequenza aminoacidica primaria la presenza di epitopi stimolanti i linfociti T helper ed indiretti quali gli algoritmi SETTE e ANN (Artificial Neural Network) che predicono i peptidi che vengono riconosciuti dai complessi maggiori di istocompatibilità. Sulle sequenze proteiche, inoltre, è stata effettuata la predizione delle regioni ordinate/disordinate mediante il predittore DISOPRED e la predizione dei siti di fosforilazione utilizzando i tools DISPHOS e NetPhos. Le sequenze proteiche analizzate mostrano una organizzazione in due domini strutturali indipendenti con la presenza di due principali regioni disordinate. Sono inoltre stati evidenziati diversi siti di fosforilazione. Nonostante la presenza di numerose mutazioni e delezioni che coinvolgono intere triplette del gene N, non si sono riscontrate mutazioni costanti in grado di differenziare ceppi virulenti ed avirulenti. L’analisi filogenetica condotta sulle sequenze nucletidiche ed aminoacidiche del gene N evidenzia una netta separazione dei ceppi virali sulla base dell’origine geografica piuttosto che sulle caratteristiche di virulenza.

Analisi strutturale ed antigenica della proteina N di ceppi di Coronavirus felini (FCoVs)

BASSANI, MILENA;BALBONI, ANDREA;BATTILANI, MARA
2007

Abstract

I Coronavirus felini (FCoVs) sono virus a RNA che colpiscono i felidi domestici e selvatici determinando una grave patologia la Peritonite Infettiva Felina (FIP). I virioni contengono 3 principali proteine strutturali: la proteina dello spike S, la proteina di membrana M e la proteina del nucleocapside N. Per altre specie di coronavirus, si è dimostrato il coinvolgimento della proteina N nella stimolazione di un’immunità proteggente. Considerato che nel caso dei FCoVs soltanto l’immunità cellulo-mediata previene lo sviluppo della malattia, nel presente lavoro è stata valutata la presenza di domini immuno-stimolanti in ceppi di FCoVs identificati in soggetti portatori sani e malati. Si è pertanto proceduto al sequenziamento dell'intero gene strutturale N, di circa 1130 bp, di 71 ceppi virali, in parte raccolti nell'ambito di screening effettuati presso oasi feline ed allevamenti ed in parte afferenti al dipartimento a scopo diagnostico. Le sequenze ottenute sono state sottoposte ad analisi bio-informatiche ai fini di identificare nel profilo antigenico differenze di rilievo tra ceppi virulenti ed avirulenti e di aumentare le conoscenze relative alla struttura ed organizzazione della proteina N. Le sequenze sono state allineate mediante il metodo ClustalW ed è stata effettuata la predizione dei siti antigenici mediante algoritmi specifici, implementati in diversi software, che utilizzano metodi diretti, quali l’algoritmo AMPHI, in grado di identificare sulla base della sequenza aminoacidica primaria la presenza di epitopi stimolanti i linfociti T helper ed indiretti quali gli algoritmi SETTE e ANN (Artificial Neural Network) che predicono i peptidi che vengono riconosciuti dai complessi maggiori di istocompatibilità. Sulle sequenze proteiche, inoltre, è stata effettuata la predizione delle regioni ordinate/disordinate mediante il predittore DISOPRED e la predizione dei siti di fosforilazione utilizzando i tools DISPHOS e NetPhos. Le sequenze proteiche analizzate mostrano una organizzazione in due domini strutturali indipendenti con la presenza di due principali regioni disordinate. Sono inoltre stati evidenziati diversi siti di fosforilazione. Nonostante la presenza di numerose mutazioni e delezioni che coinvolgono intere triplette del gene N, non si sono riscontrate mutazioni costanti in grado di differenziare ceppi virulenti ed avirulenti. L’analisi filogenetica condotta sulle sequenze nucletidiche ed aminoacidiche del gene N evidenzia una netta separazione dei ceppi virali sulla base dell’origine geografica piuttosto che sulle caratteristiche di virulenza.
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Bassani M.; Paltrinieri S.; Gelain M.E.; Balboni A.; Battilani M.
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