INTRODUZIONE. I lattobacilli rappresentano un vasto genere di batteri che colonizzano diverse sedi dell’organismo umano, dove svolgono un ruolo chiave nel mantenimento dell’omeostasi microbica. Sebbene il loro ruolo come microrganismi ‘health-promoting’ sia ben riconosciuto, la loro identificazione a livello di specie pone ancora numerose difficoltà e si basa sulla combinazione di differenti approcci. Scopo del presente lavoro è stato quello di valutare l’accuratezza della spettrometria di massa MALDI-TOF per l’identificazione di specie di ceppi di lattobacilli, comparando tale metodica con il classico approccio basato sul sequenziamento del gene 16s rRNA. MATERIALI E METODI. Sono stati inclusi nello studio 40 ceppi di lattobacilli, isolati da campioni clinici (n=27), presenti in formulazioni di probiotici (n=8) o di origine alimentare (n=5). L’identificazione di specie è stata ottenuta mediante sequenziamento del gene 16s rRNA e il relativo albero filogenetico è stato costruito mediante software MEGA 6. L’analisi spettrometrica è stata condotta sia direttamente da colonia batterica su terreno solido sia dopo estrazione proteica con acido formico/acetonitrile. I campioni sono stati analizzati con lo strumento Bruker MicroFlex MALDI-TOF MS e l’identificazione è stata ottenuta confrontando lo spettro proteico con il database di riferimento. Inoltre, a partire dallo spettro medio di ogni ceppo, è stato costruito un dendrogramma, tramite il software Biotyper 3.1. RISULTATI. Il sequenziamento del gene 16s rRNA ha portato alle seguenti identificazioni: 7 L. crispatus, 7 L. gasseri, 5 L. acidophilus, 5 L. delbrueckii, 2 L. vaginalis, 2 L. reuteri, 6 L. plantarum, 1 L. pentosus, 2 L. rhamnosus, 2 L. casei/paracasei e 1 L. brevis. L’analisi MALDI-TOF ha evidenziato elevati score identificativi (score medio≥1,9) sia in caso di analisi diretta, sia dopo estrazione proteica. Tale approccio ha consentito di identificare correttamente a livello di specie tutti i ceppi di lattobacilli tranne uno (L. pentosus vs L. plantarum), con una percentuale di concordanza con il sequenziamento del 97,5%. A tale riguardo, la stretta relazione filogenetica fra le due specie spiega questo risultato. In alcuni casi, a differenza del sequenziamento, la spettrometria di massa ha addirittura consentito l’identificazione batterica a livello di sub-specie (es. L. delbrueckii). Infine, il dendrogramma proteomico ha mostrato un’elevata sovrapponibilità con quello costruito mediante analisi genomica. CONCLUSIONI. La spettrometria di massa MALDI-TOF si è dimostrata altamente affidabile nell’identificazione di specie di diversi lattobacilli, rappresentando un’ottima alternativa al sequenziamento genico, grazie alla sua rapidità e semplicità di utilizzo. Inoltre, potrebbe rappresentare un metodo innovativo per studi tassonomici dei lattobacilli.

Accuratezza della spettrometria di massa MALDI-TOF nell’identificazione di specie di lattobacilli

FOSCHI, CLAUDIO;PAROLIN, CAROLA ELEONORA;GIORDANI, BARBARA;CEVENINI, ROBERTO;VITALI, BEATRICE;MARANGONI, ANTONELLA
2016

Abstract

INTRODUZIONE. I lattobacilli rappresentano un vasto genere di batteri che colonizzano diverse sedi dell’organismo umano, dove svolgono un ruolo chiave nel mantenimento dell’omeostasi microbica. Sebbene il loro ruolo come microrganismi ‘health-promoting’ sia ben riconosciuto, la loro identificazione a livello di specie pone ancora numerose difficoltà e si basa sulla combinazione di differenti approcci. Scopo del presente lavoro è stato quello di valutare l’accuratezza della spettrometria di massa MALDI-TOF per l’identificazione di specie di ceppi di lattobacilli, comparando tale metodica con il classico approccio basato sul sequenziamento del gene 16s rRNA. MATERIALI E METODI. Sono stati inclusi nello studio 40 ceppi di lattobacilli, isolati da campioni clinici (n=27), presenti in formulazioni di probiotici (n=8) o di origine alimentare (n=5). L’identificazione di specie è stata ottenuta mediante sequenziamento del gene 16s rRNA e il relativo albero filogenetico è stato costruito mediante software MEGA 6. L’analisi spettrometrica è stata condotta sia direttamente da colonia batterica su terreno solido sia dopo estrazione proteica con acido formico/acetonitrile. I campioni sono stati analizzati con lo strumento Bruker MicroFlex MALDI-TOF MS e l’identificazione è stata ottenuta confrontando lo spettro proteico con il database di riferimento. Inoltre, a partire dallo spettro medio di ogni ceppo, è stato costruito un dendrogramma, tramite il software Biotyper 3.1. RISULTATI. Il sequenziamento del gene 16s rRNA ha portato alle seguenti identificazioni: 7 L. crispatus, 7 L. gasseri, 5 L. acidophilus, 5 L. delbrueckii, 2 L. vaginalis, 2 L. reuteri, 6 L. plantarum, 1 L. pentosus, 2 L. rhamnosus, 2 L. casei/paracasei e 1 L. brevis. L’analisi MALDI-TOF ha evidenziato elevati score identificativi (score medio≥1,9) sia in caso di analisi diretta, sia dopo estrazione proteica. Tale approccio ha consentito di identificare correttamente a livello di specie tutti i ceppi di lattobacilli tranne uno (L. pentosus vs L. plantarum), con una percentuale di concordanza con il sequenziamento del 97,5%. A tale riguardo, la stretta relazione filogenetica fra le due specie spiega questo risultato. In alcuni casi, a differenza del sequenziamento, la spettrometria di massa ha addirittura consentito l’identificazione batterica a livello di sub-specie (es. L. delbrueckii). Infine, il dendrogramma proteomico ha mostrato un’elevata sovrapponibilità con quello costruito mediante analisi genomica. CONCLUSIONI. La spettrometria di massa MALDI-TOF si è dimostrata altamente affidabile nell’identificazione di specie di diversi lattobacilli, rappresentando un’ottima alternativa al sequenziamento genico, grazie alla sua rapidità e semplicità di utilizzo. Inoltre, potrebbe rappresentare un metodo innovativo per studi tassonomici dei lattobacilli.
Atti del XLV Congresso Nazionale AMCLI
57
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Foschi, C.; Parolin, C.; Giordani, B.; Compri, M.; Cevenini, R.; Vitali, B.; Marangoni, A
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