Vibrio harveyi è una specie patogena emergente per l’acquacoltura marina a livello globale, nelle specie ittiche e nei gamberi peneidi. In Dicentrarchus labrax, V. harveyi è stato isolato in episodi di mortalità durante le fasi di ingrasso (40-160 gr). 41 ceppi identificati biochimicamente come V. harveyi, appartenenti alla ceppoteca dell’Università di Bologna e del CSI (IZSVe), isolati in branzino a partire dal 2008 da 12 impianti di allevamento italiani (gabbie a mare e vasche a terra), sono stati sottoposti ad analisi comparative fenotipiche, genetiche e del profilo proteico. La capacità discriminante dei vari metodi è stata valutata raffrontando questi ceppi di campo con ceppi di referenza di V. harveyi e di Vibrionaceae filogeneticamente associate al clade Harveyi quali V. rotiferianus, V. owensii, V. campbelli, V. alginolyticus, V. parahaemolyticus, V. natriegens, V. mytili. Sono state inoltre comparate specie causa di patologia in branzino (Photobacterium damselae ssp. piscicida, P. damselae ssp. damselae, V. anguillarum, V. ordalii, V. scophthalmi) e specie isolate in ambiente marino con caratteristiche fenotipiche simili (V. vulnificus, V. gigantis, V. xuii). I ceppi rivitalizzati sono stati valutati a 25°C con prove biochimiche in macrometodo, prove in micrometodo con inoculo al 2% NaCl (API 20E, bioMérieux) e crescita su terreni differenziali e selettivi (TCBS, CHROMAgar™ Vibrio, MacConkey). L’analisi molecolare è stata condotta mediante il sequenziamento e l’analisi filogenetica del gene uridina monofosfato chinasi (PyrH) e l’amplificazione mediante PCR-end point specie-specifica (gene toxR). La metodica in spettrometria di massa MALDI-TOF ha analizzato mediante il MALDI Biotyper Microflex LT con software Maldi Biotyper 3.0 (BrukerDaltonics), il contenuto proteico ribosomiale di colonie di 24 h. Gli spettri MSP ottenuti dai ceppi in esame sono stati comparati con il database BrukerDaltonics implementato con ceppi Vibrio spp. di referenza standardizzati (93 ceppi) in quanto privo di queste specie. I risultati dei dati fenotipici (28 parametri) elaborati statisticamente applicando il coefficiente di Gower hanno permesso una clusterizzazione efficace (40 ceppi su 41 analizzati) dei ceppi di campo con i due V. harveyi di referenza. Sono risultate discriminanti le prove in micrometodo di arginina deidrolasi (ADH), lisina decarbossilasi (LDC), ornitina decarbossilasi (ODC), e del citrato (CIT) associate alla colorazione di CHROMAgar™ Vibrio a 48 h e TCBS. L’analisi molecolare delle sequenze del gene PyrH ha permesso una clusterizzazione coerente dei ceppi di campo e di referenza con le sequenze in letteratura. L’analisi del gene toxR speciespecifico ha prodotto un amplificato di 380 bp unicamente nei ceppi di V. harveyi di campo e di referenza L’esito MALDI-TOF ha rispecchiato l’assegnazione di specie ottenuta dal genotipo. 40 ceppi di campo sono stati assegnati con I e II best match a V. harveyi (score > 2,3); un solo ceppo di campo ha presentato best match (score 2,25) con V. diabolicus e II match (score 2,24) con V. harveyi. Le analisi sin qui condotte hanno evidenziato un’ottima concordanza nell’identificazione di ceppi di V. harveyi. Le prove fenotipiche sono state complessivamente in grado di discriminare V. harveyi dai congeneri, tuttavia dai dati in bibliografia si riscontra una certa variabilità nei risultati biochimici per le prove ritenute discriminanti. L’analisi del gene toxR risulta più rapida del sequenziamento del gene PyrH. L’identificazione mediante MALDI-TOF appare economica, rapida ed efficiente grazie all’implementazione preliminare del database BrukerDaltonics.

APPROCCIO POLIFASICO ALL’IDENTIFICAZIONE DI VIBRIO HARVEYI: FENOTIPICO, GENETICO E PROTEOMICO

PRETTO, TOBIA;FLORIO, DANIELA;FIORAVANTI, MARIALETIZIA
2015

Abstract

Vibrio harveyi è una specie patogena emergente per l’acquacoltura marina a livello globale, nelle specie ittiche e nei gamberi peneidi. In Dicentrarchus labrax, V. harveyi è stato isolato in episodi di mortalità durante le fasi di ingrasso (40-160 gr). 41 ceppi identificati biochimicamente come V. harveyi, appartenenti alla ceppoteca dell’Università di Bologna e del CSI (IZSVe), isolati in branzino a partire dal 2008 da 12 impianti di allevamento italiani (gabbie a mare e vasche a terra), sono stati sottoposti ad analisi comparative fenotipiche, genetiche e del profilo proteico. La capacità discriminante dei vari metodi è stata valutata raffrontando questi ceppi di campo con ceppi di referenza di V. harveyi e di Vibrionaceae filogeneticamente associate al clade Harveyi quali V. rotiferianus, V. owensii, V. campbelli, V. alginolyticus, V. parahaemolyticus, V. natriegens, V. mytili. Sono state inoltre comparate specie causa di patologia in branzino (Photobacterium damselae ssp. piscicida, P. damselae ssp. damselae, V. anguillarum, V. ordalii, V. scophthalmi) e specie isolate in ambiente marino con caratteristiche fenotipiche simili (V. vulnificus, V. gigantis, V. xuii). I ceppi rivitalizzati sono stati valutati a 25°C con prove biochimiche in macrometodo, prove in micrometodo con inoculo al 2% NaCl (API 20E, bioMérieux) e crescita su terreni differenziali e selettivi (TCBS, CHROMAgar™ Vibrio, MacConkey). L’analisi molecolare è stata condotta mediante il sequenziamento e l’analisi filogenetica del gene uridina monofosfato chinasi (PyrH) e l’amplificazione mediante PCR-end point specie-specifica (gene toxR). La metodica in spettrometria di massa MALDI-TOF ha analizzato mediante il MALDI Biotyper Microflex LT con software Maldi Biotyper 3.0 (BrukerDaltonics), il contenuto proteico ribosomiale di colonie di 24 h. Gli spettri MSP ottenuti dai ceppi in esame sono stati comparati con il database BrukerDaltonics implementato con ceppi Vibrio spp. di referenza standardizzati (93 ceppi) in quanto privo di queste specie. I risultati dei dati fenotipici (28 parametri) elaborati statisticamente applicando il coefficiente di Gower hanno permesso una clusterizzazione efficace (40 ceppi su 41 analizzati) dei ceppi di campo con i due V. harveyi di referenza. Sono risultate discriminanti le prove in micrometodo di arginina deidrolasi (ADH), lisina decarbossilasi (LDC), ornitina decarbossilasi (ODC), e del citrato (CIT) associate alla colorazione di CHROMAgar™ Vibrio a 48 h e TCBS. L’analisi molecolare delle sequenze del gene PyrH ha permesso una clusterizzazione coerente dei ceppi di campo e di referenza con le sequenze in letteratura. L’analisi del gene toxR speciespecifico ha prodotto un amplificato di 380 bp unicamente nei ceppi di V. harveyi di campo e di referenza L’esito MALDI-TOF ha rispecchiato l’assegnazione di specie ottenuta dal genotipo. 40 ceppi di campo sono stati assegnati con I e II best match a V. harveyi (score > 2,3); un solo ceppo di campo ha presentato best match (score 2,25) con V. diabolicus e II match (score 2,24) con V. harveyi. Le analisi sin qui condotte hanno evidenziato un’ottima concordanza nell’identificazione di ceppi di V. harveyi. Le prove fenotipiche sono state complessivamente in grado di discriminare V. harveyi dai congeneri, tuttavia dai dati in bibliografia si riscontra una certa variabilità nei risultati biochimici per le prove ritenute discriminanti. L’analisi del gene toxR risulta più rapida del sequenziamento del gene PyrH. L’identificazione mediante MALDI-TOF appare economica, rapida ed efficiente grazie all’implementazione preliminare del database BrukerDaltonics.
Atti del XXI Convegno Nazionale S.I.P.I. Società Italiana Patologia Ittica
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Pretto, T.; Pascoletti, S.; Zambon, M.; Manfrin, A.; Florio, D.; Fioravanti, M.L.
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