DETERMINAZIONE DELLA PRODUZIONE DI CARBAPENEMASI IN ENTEROBATTERI CON RIDOTTA SENSIBILITA’ AI CARBAPENEMI MEDIANTE METODICA LC-MS (LIQUID CHROMATOGRAPHY-MASS SPECTROMETRY)

INTRODUZIONE Le resistenza ai carbapenemi negli enterobatteri rappresenta ad oggi la principale problematica di antibiotico-resistenza. Negli ultimi anni nel contesto epidemiologico italiano si è osservata una rapida diffusione di microrganismi con queste caratteristiche, legata principalmente a Klebsiella pneumoniae produttrice di carbapenemasi KPC. Una rapida e corretta definizione della produzione di carbapenemasi riveste notevoli implicazioni sia da un punto di vista clinico che epidemiologico per la necessità di mettere in atto il più precocemente possibile una terapia antibiotica appropriata e le idonee misure preventive. In questo lavoro abbiamo valutato la performance analitica di un saggio di LC-MS (Liquid Chromatography Mass Spectrometry) nel determinare la produzione di carbapenemasi in isolati di enterobatteri. MATERIALI E METODI Sono stati selezionati per lo studio 48 isolati clinici (40 K.pneumoniae, 4 E.coli, 4 C.freundii) precedentemente caratterizzati: 20 ceppi produttori di carbapenemasi KPC, 10 di metallo-βlattamasi (MBL), 6 di OXA-48, 12 non produttori di carbapenemasi (6 con ridotta sensibilità ai carbapenemi da produzione di ESBL con deficit di porine e 6 wild-type). La metodica di valutazione della produzione di carbapenemasi prevede l’incubazione per 1 ora a 37°c dei ceppi in esame in presenza di meropenem ad una concentrazione di 0.05 mg/ml. In seguito si procede ad una centrifugazione ed il sovranatante viene utilizzato per il dosaggio del meropenem mediante LC-MS, metodica che coniuga la cromatografia liquida alla spettrometria di massa. L’analisi è stata eseguita su sistema HPLC Prominance UFLC-XR (Shimadzu) accoppiato a spettrometro di massa triplo quadrupolo API 4000 QTRAP (AB Sciex). Una curva di calibrazione permette di ottenere una quantificazione assoluta, mentre l’attività carbapenemasica è stata valutata in base al rapporto tra la concentrazione di meropenem nei campioni incubati con i ceppi e quella dell’antibiotico incubato in assenza di batteri (ratio). RISULTATI Tutti i ceppi produttori di KPC hanno evidenziato una rapida attività di degradazione del meropenem, determinando valori di ratio inferiori a 0.2 in 19 dei 20 campioni. Per gli isolati produttori di MBL i valori di ratio sono risultati tutti inferiori a 0.6, mentre per quelli positivi per OXA-48 in 2 casi i valori di ratio sono risultati sovrapponibili a quelli ottenuti per i ceppi produttori di ESBL. Complessivamente, utilizzando un cut-off di ratio ottimale identificato ad un valore di 0.75, la sensibilità del metodo nel determinare la produzione di carbapenemasi è risultata pari al 94.4%, la specificità del 100%. CONCLUSIONI La metodica di LC-MS valutata in questo studio ha dimostrato una elevata affidabilità diagnostica nella valutazione dell’attività carbapenemasica da parte di ceppi di enterobatteri. La sensibilità non ottimale ottenuta su isolati produttori di OXA-48 è probabilmente legata ad una più lenta attività enzimatica di questa specifica βlattamasi