Identificazione ed analisi delle isoforme geniche e proteiche di RCAN3 (DSCR1L2)

Il gene umano RCAN3 (Regulator of Calcineurin 3, anche conosciuto come DSCR1L2), localizzato sul cromosoma 1 (1p36.11), appartiene alla famiglia genica RCAN, di cui gli altri membri sono i geni RCAN1 ed RCAN2. Recentemente il Comitato internazionale HUGO ha proposto per i geni e le proteine di questa famiglia la nomenclatura presentata per la prima volta in questo lavoro; nomenclatura che è stata ampiamente discussa anche nell’ambito di un “Forum article” in via di pubblicazione. Il gene RCAN3 è costituito da 5 esoni e ad oggi sono state identificate due isoforme alternative: RCAN3-2,3,4b,5, che manca di 30 nucleotidi all’inizio dell’esone 4 e codifica per una proteina priva di 10 amminoacidi nella sua porzione centrale (RCAN3-2,3,4b,5) ed RCAN3-2,5 che manca degli esoni 3-4 e codifica per una proteina di 115 amminoacidi, con una porzione proteica C-terminale diversa da RCAN3, a causa di uno scivolamento del modulo di lettura a partire dall’esone 5 (RCAN3-2,5). Ad oggi più di un centinaio di lavori sono stati pubblicati sulla famiglia RCAN e nella maggior parte sono presentati studi sulle funzioni di RCAN1 ed RCAN2. Solo due lavori si sono occupati dei possibili ruoli di RCAN3. Recentemente il nostro gruppo di ricerca, mediante un saggio dei due ibridi condotto in una genoteca di cDNA di cuore umano, ha dimostrato che RCAN3 ed RCAN3-2,5 sono in grado di interagire con la troponina inibitoria cardiaca (TNNI3), una delle principali componenti dell’apparato contrattile muscolare; inoltre Mulero e colleghi hanno identificato nella calcineurina, una fosfatasi calcio-calmodulina dipendente, un altro possibile interattore di RCAN3. Lo scopo del presente lavoro è stato condurre una analisi delle diverse isoforme di RCAN3 e delle rispettive proteine da un punto di vista molecolare, bioinformatico, di espressione genica e funzionale. In primo luogo sono state identificate grazie ad un clonaggio mediante RT-PCR due nuove isoforme di RCAN3, in accordo con l’elevato numero di splicing dimostrato nei geni umani: RCAN3-2,4,5 che manca dell’esone 3 ed RCAN3-2,3,5, che manca dell’esone 4. Sequenze di cDNA per le isoforme alternative di RCAN3 sono state identificate solo in Homo sapiens, utilizzando come strumenti per tale ricerca il programma BLASTN, ECgene Browser e Genome Browser; solo per l’isoforma RCAN3-2,4,5 sono state ritrovate 2 EST. In seguito è stata condotta una RT-PCR quantitativa relativa per analizzare il pattern di espressione delle 5 isoforme note in 7 tessuti umani normali (cuore, cervello, polmone, prostata, testicolo, leucociti, intestino tenue), basandosi su dati precedentemente raccolti che dimostravano come il gene RCAN3 fosse espresso in diversi tessuti.Tutte le isoforme sono risultate espresse nei singoli tessuti e in tutti i tessuti si è dimostrato che l’isoforma più espressa è RCAN3. Inoltre il livello di espressione dell’intero locus RCAN3 è risultato confrontabile in tutti i tessuti, dimostrandone l’ubiquitarietà. Infine, grazie ad un saggio di cotrasformazione in lievito e ad un saggio in vitro di legame alla GST, è stata dimostrata l’interazione delle due nuove isoforme identificate RCAN3-2,4,5 e RCAN3-2,3,5 con la TNNI3, così come si poteva ipotizzare grazie alla presenza dell’esone 2, il cui prodotto è ritenuto essere sufficiente per il legame a tale proteina cardiaca.