DNA topoisomerasi I e sviluppo di nuovi inibitori.

Le DNA topoisomerasi regolano la topologia del DNA durante molti processi nucleari fondamentali. La topoisomerasi I eucariotica (Top1) è essenziale negli organismi multicellulari, ed è il bersaglio di efficaci agenti antitumorali come la camptotecina (CPT). L'enzima agisce accoppiando un' attività di rottura/ricongiunzione del DNA con la rotazione di un filamento intorno all'altro. CPT stabilizza l'intermedio covalente DNA-Top1 nel quale un filamento del DNA è tagliato e legato covalentemente a Top1. Sono state risolte le strutture cristalline dell’enzima umano che hanno permesso di ottenere importanti informazioni sul meccanismo catalitico e sul sito recettoriale della CPT e di altri farmaci. Comunque, il meccanismo di interferenza dei farmaci con il ciclo catalitico di Top1 non è ancora stabilito nei dettagli. La presente ricerca si propone di approfondire le relazioni struttura-funzione delle Top1 utilizzando un approccio altamente integrato e multidisciplinare di biologia molecolare, modellistica molecolare e chimica organica. I nostri obbiettivi sono: 1. la definizione del ruolo funzionale di domini di Top1 nell’attività di rilassamento e rottura del DNA; 2. la definizione delle relazioni struttura-attività dei domini N-terminale e linker; 3. la definizione di altri ruoli principali di Top1 nella trascrizione e nella regolazione della trascrizione; 4. l’identificazione di un nuovo pathway molecolare attivato da CPT e dipendente dalla trascrizione; 5. la definizione del ruolo di fattori del TCR nella risposta e/o recupero della trascrizione e del reclutamento sulal cromatina di Pol II dopo CPT; 6. la definizione dei profili di espressione genica in lievito dopo trattamenti di CPT; 7. il disegno e lo sviluppo di nuovi “lead” di inibitori della Top1 caratterizzati da alta attività antitumorale. Molte varianti della Top1 umana e di lievito sono disponibili nei nostri laboratori e altre saranno sviluppate con metodiche convenzionali. Le proprietà biochimiche e le funzioni cellulari saranno studiate in vitro e in vivo in cellule di lievito. La completa caratterizzazione delle proprietà dei mutanti di Top1 permetterà di comprendere gli effetti sui profili di espressione in lievito in relazione all'attività di Top1. Inoltre, alterazioni della trascrizione genica globale in seguito ai danni indotti da CPT saranno studiati per definire la risposta globale a trattamenti con CPT e dipendenti da Top1. Localizzando Top1 e altre proteine nella cromatina attiva cercheremo di ottenere informazioni sulle funzioni dell’enzima nell’organizzazione della cromatina e nella regolazione dell’espressione nei loci studiati. Inoltre, localizzando le proteine in regioni trascritte in fibroblasti umani normali e mutati nel TCR e in cellule di lievito, cercheremo di chiarire il ruolo dei fattori del TCR nella risposta e /o recupero della trascrizione e del reclutamento di Pol II dopo danni indotti in cellule trattate con CPT in regioni trascritte della cromatina. Inoltre, differenti forme troncate nell’N-terminale di Top1 ci forniranno informazioni su motivi specifici che indirizzano la Top1 umana in specifiche regioni del DNA. Tecniche di mutagenesi sito-specifica saranno utilizzate per costruire specifiche varianti dellaTop1 umana con doppie mutazioni nel linker e nel dominio N-terminale per cercare di ottenere informazioni sulle relazioni struttura–funzione e verificare l’ipotesi della rotazione controllata. Inoltre, studi di modellistica molecolare (meccanica e dinamica) saranno svolti per studiare le proprietà strutturali di enzimi resistenti e ipersensibili alla CPT. I risultati ci forniranno nuove informazioni sul comportamento meccanicistico del dominio linker durante l’attività di Top1. Allo stesso tempo, un disegno razionale di strutture minime con attività farmacologia contro Top1 consentirà di sviluppare una nuova classe di specifici ed efficienti farmaci diretti contro Top1 e con promettente attività antitumorale.