Sviluppo di un saggio immunochemiluminescente per la determinazione di imidacloprid in ape

L’ape, ormai da diversi anni, è considerata un valido bioindicatore ambientale per il controllo dell’inquinamento dovuto all’azione di un ingente numero di contaminanti Porrini C. et al., 2002. In particolare, l'ape risulta essere un buon indicatore diretto (bioindicatore) degli insetticidi rispondendo alla loro immissione nell’ambiente con un rilevante numero di api morte, mentre nel caso di principi attivi non particolarmente pericolosi (ad es. erbicidi) l’insetto funziona come indicatore indiretto (bioaccomulatore) e ci fornisce informazioni sotto forma di residui. Scopo di questo lavoro è stata la messa a punto di un dosaggio immunoenzimatico ELISA di tipo competitivo per l’analisi qualitativa e quantitativa di Imidacloprid che fosse rapido e sensibile e che potesse essere impiegato per lo screening di un grande numero di campioni. In particolare, sono stati impiegati anticorpi monoclonali, dotati quindi di elevata specificità, e micropiastre a 96 pozzetti. L’Imidacloprid è un insetticida sistemico relativamente recente appartenente alla classe dei cloronicotinili, che presenta un’elevata affinità per il recettore nicotinico dell’acetilcolina. È un prodotto ampiamente utilizzato in agricoltura e in ambito domestico, la cui presenza viene generalmente rivelata tramite HPLC con una procedura laboriosa. Secondo alcuni autori, imidacloprid è “altamente tossico” per Apis mellifera, mentre altri sono favorevoli all’uso del principio attivo. Il saggio ELISA è stato messo a punto valutando diversi parametri specifici (concentrazione degli immunoreagenti) e aspecifici (effetto di solventi organici). Il limite di rivelazione è risultato pari a 0,11 ng/g con un IC50=14 ng/ml. Il metodo chemiluminescente è stato confrontato con quello colorimetrico messo a punto con gli stessi reagenti, ottenendo una sensibilità, espressa come IC50, migliore con la rivelazione luminescente (14 ng/ml per il chemiluminescente, 35 ng/mL per il colorimetrico), impiegando quantità uguali di immunoreagenti. Il saggio è risultato più sensibile anche di quelli convenzionalmente utilizzati (LOD = 4ng/mL) [Schöning R., 2003]. Successivamente, sono state eseguite prove di reattività crociata con i principali metaboliti dell’imidacloprid, rivelando la notevole specificità degli immunoreagenti utilizzati. Il saggio è stato poi applicato a estratti di api forniti dalla Cooperativa La Carlina. Il problema principale riscontrato nell’analisi di questo tipo di campioni è stato l’elevato effetto matrice dell’ape sul saggio ELISA. I campioni di api analizzati sono stati estratti con ripartizione liquido/liquido; con questa metodica, tuttavia, possono essere estratte anche sostanze lipofile di cui è naturalmente composta l’ape. Fortunatamente, il saggio ELISA messo a punto per la determinazione dell’Imidacloprid, pur mostrando l’interferenza della matrice ape, consente di ottenere buoni recuperi percentuali (≥ 60 %) per i campioni più diluiti (dil. 1:100). Recuperi percentuali paragonabili sono stati ottenuti con la metodica HPLC-MS. Il saggio si è quindi rivelato efficace per la determinazione della presenza di imidacloprid nella matrice ape. Porrini C., Ghini S., Girotti S., Sabatini A.G., Gattavecchia E., Celli G. “Use of honey bees as bioindicators of environmental pollution in Italy”. In: “Honey Bees: The Environmental Impact of Chemicals” J.Devillers and M.H.Pham-Delègue, Editors, Routledge-Taylors & Francis Group, London, pages 186-247, 2002. Schöning R., Schmuck R., “Analytical determination of Imidacloprid and relevant metabolite residues by LC MS/MS”. Bulletin of Insectology, 2003, 56(1): 41-50