IL GENE CYYR1 IN TUMORI NEUROENDOCRINI UMANI

Tramite analisi di sequenze EST (Expressed Sequence Tags) è stato osservato che il gene umano CYYR1 (cysteine/tyrosine-rich 1) mostra un’alta espressione in cellule appartenenti al sistema APUD (Amine Precursor Uptake and Decarboxylation). E’ noto che anomalie del differenziamento cellulare in cellule APUD sono spesso alla base di alcuni tipi di tumore di origine neuroendocrina (APUDomi), come le neoplasie endocrine multiple, i tumori carcinoidi, il feocromocitoma e il melanoma. E’ stata analizzata, mediante RT-PCR specifica e successivo sequenziamento, l’intera sequenza codificante (CDS) dell’mRNA di CYYR1 umano in 32 tumori neuroendocrini (NE). In tutti i campioni analizzati la CDS di CYYR1 è risultata sovrapponibile a quella di riferimento con eccezione della sequenza ottenuta dall’unico tumore localizzato nel collo, un carcinoma scarsamente differenziato con aspetti neuroendocrini. In quest’ultimo caso, l’analisi ha evidenziato la presenza di una mutazione, in eterozigosi, in posizione 333 della CDS (T al posto di C) che porta alla sostituzione amminoacidica P111S. L’analisi di sequenza, inoltre, ha mostrato chiaramente l’esistenza di due isoforme di mRNA dovuta alla presenza di due possibili siti accettori di splicing all’estremo 3¢ dell’introne 3 che termina con la sequenza CAGCAG (splicing alternativo “sottile”). Tale splicing alternativo è presente anche nei tessuti normali. Le due isoforme di mRNA prodotte differiscono per una tripletta CAG (CAG-: assenza della tripletta, CAG+: presenza della tripletta); ne derivano due prodotti proteici putativi diversi per assenza o presenza di un residuo di alanina nel punto di giunzione fra esone 3 ed esone 4. E’ stata successivamente quantificata l’espressione relativa delle due isoforme messaggeriali (CAG- e CAG+) in 29 tumori NE e in 8 tessuti normali tramite un metodo che si basa su una RT-PCR condotta in condizioni altamente standardizzate e stringenti. Il metodo impiega la beta-2 microglobulina (B2M) come gene di riferimento e i risultati della elettroforesi dei prodotti di PCR sono elaborati con un analizzatore di immagini (Gel Doc 2000). Nei campioni tumorali è stata ritrovata una espressione significativamente più bassa della isoforma CAG- rispetto ai controlli normali in un rapporto di 2:3 (p=0,022). Infine abbiamo condotto un’analisi bioinformatica per verificare o meno la presenza delle due isoforme degli ortologhi di CYYR1 in altre specie: solo in Pan troglodites si può ipotizzare l’esistenza delle due isoforme per la presenza, nella sequenza genomica, di un confine introne-esone analogo a quello umano.