È noto che i metodi classici di clonaggio del cDNA sono influenzati da una potenziale incapacità di amplificare efficacemente la regione 5´ dell’mRNA. Dato che la sequenza amminoacidica dei prodotti genici è di norma dedotta dalla sequenza dei nucleotidi del relativo cDNA clonato, è importante verificare che una sequenza codificante identificata (o open reading frame, ORF) sia quanto più possibile completa al relativo 5´. In studi precedenti abbiamo dimostrato, mediante analisi bioinformatica accurata e successivo clonaggio del cDNA (reazione a catena della polimerasi dopo retrotrascrizione, RT-PCR), che in 4 su 109 geni noti localizzati sul cromosoma 21 umano, le ORF annotate erano incomplete all’estremità 5´. Scopo del presente lavoro è stato valutare la completezza nella regione 5´ delle sequenze ORF di mRNA di Danio rerio (zebrafish), organismo modello sempre più utilizzato in studi di genomica. Abbiamo sviluppato un innovativo metodo automatizzato che consente di: 1) confrontare in modo sistematico le EST (expressed sequence tags, etichette di sequenze espresse) disponibili con tutte le sequenze di mRNA conosciute di Danio rerio; 2) identificare eventuali tratti di sequenza da aggiungere nella regione 5´; 3) verificare la presenza di tutte le condizioni necessarie a dimostrare l’esistenza di una nuova ORF estesa. Queste condizioni sono, in breve, la presenza di un nuovo “primo codone AUG” in fase con quello precedentemente descritto e la mancanza di uno qualsiasi dei tre codoni di stop in fase tra il codone di recente identificazione e quello inizialmente annotato. Il nostro programma ha analizzato gli 8.528 mRNAs di Danio rerio estratti dal database RefSeq (disponibili al 31/12/2005) e ha permesso di identificare 265 (3,1%) mRNA con ORF potenzialmente incomplete nella regione 5´. Attraverso RT-PCR e sequenziamento automatico abbiamo dimostrato per tre geni (selt1a, unc119, nppa), scelti tra quelli candidati, che la regione codificante all'estremità 5' era stata caratterizzata in modo incompleto nelle descrizioni originali. La conoscenza delle ORF complete dell’mRNA assume una particolare valenza in zebrafish per gli studi di localizzazione del prodotto genico, di sovraespressione genica nonché per la realizzazione di organismi knockdown mediante oligonucleotidi morfolinici. Il metodo sviluppato, la cui utilizzazione è applicabile anche all’analisi di altri genomi, ha consentito di descrivere in questo lavoro la rilevanza del problema dell’incompleta caratterizzazione delle estremità 5´ degli mRNA e di sottolinearne le possibili conseguenze nell’ambito dell'annotazione genomica e degli esperimenti funzionali eventualmente progettati in zebrafish.

INCOMPLETEZZA DI SEQUENZA DELLA REGIONE 5´ DELL’mRNA: ANALISI SISTEMATICA IN DANIO RERIO (ZEBRAFISH)

FRABETTI, FLAVIA;CASADEI, RAFFAELLA;LENZI, LUCA;CANAIDER, SILVIA;VITALE, LORENZA;FACCHIN, FEDERICA;CARINCI, PAOLO;ZANNOTTI, MARIA;STRIPPOLI, PIERLUIGI
2006

Abstract

È noto che i metodi classici di clonaggio del cDNA sono influenzati da una potenziale incapacità di amplificare efficacemente la regione 5´ dell’mRNA. Dato che la sequenza amminoacidica dei prodotti genici è di norma dedotta dalla sequenza dei nucleotidi del relativo cDNA clonato, è importante verificare che una sequenza codificante identificata (o open reading frame, ORF) sia quanto più possibile completa al relativo 5´. In studi precedenti abbiamo dimostrato, mediante analisi bioinformatica accurata e successivo clonaggio del cDNA (reazione a catena della polimerasi dopo retrotrascrizione, RT-PCR), che in 4 su 109 geni noti localizzati sul cromosoma 21 umano, le ORF annotate erano incomplete all’estremità 5´. Scopo del presente lavoro è stato valutare la completezza nella regione 5´ delle sequenze ORF di mRNA di Danio rerio (zebrafish), organismo modello sempre più utilizzato in studi di genomica. Abbiamo sviluppato un innovativo metodo automatizzato che consente di: 1) confrontare in modo sistematico le EST (expressed sequence tags, etichette di sequenze espresse) disponibili con tutte le sequenze di mRNA conosciute di Danio rerio; 2) identificare eventuali tratti di sequenza da aggiungere nella regione 5´; 3) verificare la presenza di tutte le condizioni necessarie a dimostrare l’esistenza di una nuova ORF estesa. Queste condizioni sono, in breve, la presenza di un nuovo “primo codone AUG” in fase con quello precedentemente descritto e la mancanza di uno qualsiasi dei tre codoni di stop in fase tra il codone di recente identificazione e quello inizialmente annotato. Il nostro programma ha analizzato gli 8.528 mRNAs di Danio rerio estratti dal database RefSeq (disponibili al 31/12/2005) e ha permesso di identificare 265 (3,1%) mRNA con ORF potenzialmente incomplete nella regione 5´. Attraverso RT-PCR e sequenziamento automatico abbiamo dimostrato per tre geni (selt1a, unc119, nppa), scelti tra quelli candidati, che la regione codificante all'estremità 5' era stata caratterizzata in modo incompleto nelle descrizioni originali. La conoscenza delle ORF complete dell’mRNA assume una particolare valenza in zebrafish per gli studi di localizzazione del prodotto genico, di sovraespressione genica nonché per la realizzazione di organismi knockdown mediante oligonucleotidi morfolinici. Il metodo sviluppato, la cui utilizzazione è applicabile anche all’analisi di altri genomi, ha consentito di descrivere in questo lavoro la rilevanza del problema dell’incompleta caratterizzazione delle estremità 5´ degli mRNA e di sottolinearne le possibili conseguenze nell’ambito dell'annotazione genomica e degli esperimenti funzionali eventualmente progettati in zebrafish.
IX Congesso AIBG Atti
15
15
Frabetti F.; Casadei R.; Lenzi L.; Canaider S.; Vitale L.; Facchin F.; Carinci P.; Zannotti M.; Strippoli P. .
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