Espressione differenziale di due isoforme del recettore per l’insulin like growth factor 1 (IGF1R) dovute a splicing alternativo “sottile” in tumori neuroendocrini umani.

E’ di recente osservazione (Hiller et al., Nat Genet, 2005) la presenza, in almeno il 30% dei geni umani, di uno splicing alternativo “sottile”, causato da una sequenza NAGNAG situata al confine fra un sito accettore di splicing intronico e l’inizio dell’esone successivo. Questa breve sequenza offre all’apparato di splicing due punti di taglio distanti solo tre basi l’uno dall’altro con conseguente trascrizione di due isoforme di mRNA che differiscono per la presenza o assenza di una tripletta NAG. Ne derivano due proteine diverse per uno o al massimo due aminoacidi. Tale differenza è sufficiente per ipotizzare una diversa funzione delle due forme, sinora dimostrata in vitro solo per l'insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R). L’attivazione del sistema insulin-like growth factor 1 (IGF1)/IGF1R è un evento cruciale nei processi di trasformazione neoplastica in diversi tumori umani. Tale sistema è stato recentemente studiato in tumori carcinoidi che sono caratterizzati da ipersecrezione di amine biologiche e di neuropeptidi responsabili delle manifestazioni sintomatologiche. Sono stati descritti due trascritti del gene IGF1R, dovuti a splicing alternativo “sottile”, che differiscono per tre nucleotidi (CAG) nella sequenza codificante. L’assenza della tripletta CAG (isoforma CAG-) dà origine ad una proteina che rispetto alla forma originariamente descritta (codificata dalla isoforma CAG+) presenta una Arginina in sostituzione della coppia Treonina-Glicina nella porzione extracellulare della subunità beta del recettore. Trasfettando con entrambe le isoforme la linea cellulare CHO si è visto che la forma CAG-, rispetto alla forma CAG+, mostra un aumento della attività mitogenica di circa due volte in risposta a IGF1. Nel presente lavoro proponiamo un metodo basato sulla reazione a catena della polimerasi dopo retrotrascrizione (reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR) per lo studio semiquantitativo della espressione differenziale di mRNA che differiscono per poche basi, e lo applichiamo alla analisi della espressione relativa delle due isoforme di mRNA di IGF1R in un’ampia casistica di tumori neuroendocrini umani (32 campioni) e in tessuti normali (9 campioni). Il metodo prevede condizioni altamente standardizzate e stringenti, impiega la beta-2 microglobulina (B2M) come gene di riferimento e i risultati della elettroforesi dei prodotti di PCR sono elaborati con un analizzatore di immagini (Gel Doc). Nei campioni tumorali è stata ritrovata una espressione significativamente più alta (di circa 2 volte) di entrambe le isoforme rispetto ai controlli normali, mentre il rapporto fra le due isoforme CAG+/CAG- si mantiene costante sia nei tipi cellulari tumorali che in quelli normali studiati (circa 3:1). Lo studio filogenetico del locus IGF1R, condotto sulle sequenze disponibili di diverse specie animali, suggerisce che l’isoforma messaggeriale IGF1R CAG- sia, da un punto di vista evoluzionistico, più recente rispetto alla isoforma CAG+, per questa ragione l’apparato di splicing potrebbe utilizzare con minor efficienza il sito di splicing che la origina. Questo lavoro sottolinea la espressione differenziale di isoforme di splicing alternativo “sottile” per il locus IGF1R e rimanda alla necessità di evidenziare e caratterizzare, con metodi di bioinformatica e di biologia molecolare, analoghe forme di splicing sottile per i geni umani noti non ancora studiati sotto questo profilo e per tutti i nuovi geni via via identificati.