I pesticidi organofosforati, nonostante la loro elevata tossicità, sono ancora fra i prodotti più utilizzati in agricoltura [Rossi S. et al., 2001]. Questi pesticidi, a seguito di un loro uso spropositato, si accumulano nell’ecosistema, determinando quindi un pericolo per tutte le specie animali e per l’uomo, che ne sono continuamente esposti. Fra i composti organofosforati, uno degli insetticidi più tossici è l’Azinfos-metile. In particolare è stata dimostrata l’elevata tossicità di questa molecola per le api ed altri insetti benefici Kamrin M.A., 1997. L’ape è infatti un insetto molto sensibile alla presenza di pesticidi, e risponde al loro utilizzo nell’ambiente con la propria morte o trattenendone dei residui nel proprio organismo, rappresentando così un valido bioindicatore ambientale per il controllo dell’inquinamento dovuto all’azione di un ingente numero di contaminanti Porrini C. et al., 2002. Scopo di questo lavoro è stata la messa a punto di un dosaggio immunoenzimatico ELISA di tipo competitivo per l’analisi qualitativa e quantitativa di pesticidi organofosforati, in particolare dell’Azinfos-metile che fosse rapido e sensibile e che potesse essere impiegato per lo screening di un grande numero di campioni. A tale scopo si è pensato di coniugare la grande sensibilità e selettività dei dosaggi immunologici con l’elevata sensibilità del sistema chemiluminescente luminolo/perossidasi. In particolare sono stati impiegati anticorpi monoclonali, dotati quindi di elevata specificità, e micropiastre a 96 pozzetti. Le tecniche più utilizzate per la determinazione dei pesticidi organofosforati sono la gas cromatografia (GC) e la cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) [Rossi S. et al., 2001], mentre l’estrazione dei campioni è generalmente basata su di una ripartizione liquido-liquido (LLE), che richiede una buona manualità e l’utilizzo di una elevata quantità di solventi [Morzycka B., 2002]. Il saggio ELISA è stato messo a punto valutando diversi parametri specifici (concentrazione degli immunoreagenti) e aspecifici (effetto di solventi organici). Il limite di rivelazione nel saggio immunoenzimatico per l’Azinfos-metile è risultato pari a 0,01 ng/mL con un IC50=0,40 nM. Il metodo chemiluminescente è stato inoltre confrontato con quello colorimetrico messo a punto con gli stessi reagenti, ottenendo una sensibilità, espressa come IC50, paragonabile per i due metodi e un limite di rivelazione leggermente inferiore per la rivelazione luminescente (0,01 ng/mL per il chemiluminescente, 0,05 ng/mL per il colorimetrico), impiegando quantità uguali o inferiori di immunoreagenti. Il saggio è stato poi applicato a estratti di api forniti dalla Cooperativa La Carlina. Il problema principale riscontrato nell’analisi di questo tipo di campioni è stato l’elevato effetto matrice dell’ape sul saggio ELISA. Sono stati quindi valutati campioni di ape estratti con due distinte metodiche, la ripartizione liquido/liquido e l’estrazione in fase solida con carbone grafitizzato, e opportunamente diluiti. Gli estratti ottenuti con questa seconda tecnica si sono rivelati i migliori per la successiva valutazione immunoenzimatica: nell’analisi di estratti con carbone si ha un recupero dello standard aggiunto mai inferiore al 60%, mentre con l’estrazione liquido/liquido si ha un recupero che va dal 20% al 40%. I risultati migliori si ottengono quindi utilizzando una metodica estrattiva molto meno laboriosa, più rapida, più a basso costo e con una netta riduzione del consumo di solventi, andando quindi ad eliminare anche il problema dello smaltimento degli stessi. Sono infine stati analizzati alcun campioni di api russe: la metodica ha consentito di individuare alcuni campioni sicuramente positivi, come confermato dall’analisi gascromatografica. L’Azinfos-metile è stato inoltre riscontrato in piccole quantità anche in altri campioni, ma in questo caso non è stato possibile il riscontro gas cromatografico po...
F.Fini, S.Girotti, S.Ghini, S.Totti, J.V.Mercader, A.Montoya, et al. (2004). Sviluppo di un saggio immunochemiluminescente per la determinazione di azinfos-metile nella matrice ape. PARMA : s.n.
Sviluppo di un saggio immunochemiluminescente per la determinazione di azinfos-metile nella matrice ape
FINI, FABIANA;GIROTTI, STEFANO;GHINI, SEVERINO;
2004
Abstract
I pesticidi organofosforati, nonostante la loro elevata tossicità, sono ancora fra i prodotti più utilizzati in agricoltura [Rossi S. et al., 2001]. Questi pesticidi, a seguito di un loro uso spropositato, si accumulano nell’ecosistema, determinando quindi un pericolo per tutte le specie animali e per l’uomo, che ne sono continuamente esposti. Fra i composti organofosforati, uno degli insetticidi più tossici è l’Azinfos-metile. In particolare è stata dimostrata l’elevata tossicità di questa molecola per le api ed altri insetti benefici Kamrin M.A., 1997. L’ape è infatti un insetto molto sensibile alla presenza di pesticidi, e risponde al loro utilizzo nell’ambiente con la propria morte o trattenendone dei residui nel proprio organismo, rappresentando così un valido bioindicatore ambientale per il controllo dell’inquinamento dovuto all’azione di un ingente numero di contaminanti Porrini C. et al., 2002. Scopo di questo lavoro è stata la messa a punto di un dosaggio immunoenzimatico ELISA di tipo competitivo per l’analisi qualitativa e quantitativa di pesticidi organofosforati, in particolare dell’Azinfos-metile che fosse rapido e sensibile e che potesse essere impiegato per lo screening di un grande numero di campioni. A tale scopo si è pensato di coniugare la grande sensibilità e selettività dei dosaggi immunologici con l’elevata sensibilità del sistema chemiluminescente luminolo/perossidasi. In particolare sono stati impiegati anticorpi monoclonali, dotati quindi di elevata specificità, e micropiastre a 96 pozzetti. Le tecniche più utilizzate per la determinazione dei pesticidi organofosforati sono la gas cromatografia (GC) e la cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) [Rossi S. et al., 2001], mentre l’estrazione dei campioni è generalmente basata su di una ripartizione liquido-liquido (LLE), che richiede una buona manualità e l’utilizzo di una elevata quantità di solventi [Morzycka B., 2002]. Il saggio ELISA è stato messo a punto valutando diversi parametri specifici (concentrazione degli immunoreagenti) e aspecifici (effetto di solventi organici). Il limite di rivelazione nel saggio immunoenzimatico per l’Azinfos-metile è risultato pari a 0,01 ng/mL con un IC50=0,40 nM. Il metodo chemiluminescente è stato inoltre confrontato con quello colorimetrico messo a punto con gli stessi reagenti, ottenendo una sensibilità, espressa come IC50, paragonabile per i due metodi e un limite di rivelazione leggermente inferiore per la rivelazione luminescente (0,01 ng/mL per il chemiluminescente, 0,05 ng/mL per il colorimetrico), impiegando quantità uguali o inferiori di immunoreagenti. Il saggio è stato poi applicato a estratti di api forniti dalla Cooperativa La Carlina. Il problema principale riscontrato nell’analisi di questo tipo di campioni è stato l’elevato effetto matrice dell’ape sul saggio ELISA. Sono stati quindi valutati campioni di ape estratti con due distinte metodiche, la ripartizione liquido/liquido e l’estrazione in fase solida con carbone grafitizzato, e opportunamente diluiti. Gli estratti ottenuti con questa seconda tecnica si sono rivelati i migliori per la successiva valutazione immunoenzimatica: nell’analisi di estratti con carbone si ha un recupero dello standard aggiunto mai inferiore al 60%, mentre con l’estrazione liquido/liquido si ha un recupero che va dal 20% al 40%. I risultati migliori si ottengono quindi utilizzando una metodica estrattiva molto meno laboriosa, più rapida, più a basso costo e con una netta riduzione del consumo di solventi, andando quindi ad eliminare anche il problema dello smaltimento degli stessi. Sono infine stati analizzati alcun campioni di api russe: la metodica ha consentito di individuare alcuni campioni sicuramente positivi, come confermato dall’analisi gascromatografica. L’Azinfos-metile è stato inoltre riscontrato in piccole quantità anche in altri campioni, ma in questo caso non è stato possibile il riscontro gas cromatografico po...I documenti in IRIS sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.