Un numero sempre maggiore di evidenze sperimentali suggerisce che le specie reattive dell'ossigeno (ROS) non sono esclusivamente sottoprodotti citotossici del metabolismo ma sono coinvolte in meccanismi di segnalazione e regolazione cellulare. Questo apparente paradosso del ruolo delle ROS può essere correlato, almeno in parte, alla differenza di concentrazione delle specie prodotte. 1) Le sorgenti cellulari di ROS, che agirebbero come messaggeri intracellulari in seguito all'attivazione dei recettori di membrana da parte citochine, fattori di crescita e ormoni, sembrano essere localizzate nella membrana plasmatica. La produzione di queste specie ossidanti potrebbe avvenire tramite sistemi di trasporto elettronico della membrana plasmatica (tPMET), la cui natura e ruolo fisiologico negli eucarioti sono ancora poco chiari. Un'altra fonte risiede nel metabolismo dei fosfolipidi di membrana: in particolare, la lipossigenasi può essere responsabile della formazione di intermedi radicalici. 2) Oltre alla generazione endogena di ROS come conseguenza di attività metabolica, molti stimoli esterni, tra i quali radiazioni UV, agenti chemioterapici, etc. generano ROS, che possono perturbare il normale bilancio redox e portare le cellule ad uno stato di stress ossidativo. Il programma prenderà in considerazione questo duplice ruolo delle ROS. 1) In un lavoro precedente abbiamo visto che l'H2O2 è in grado di mimare l'effetto di alcune citochine (TPO, GM-CSF, SCF) sul trasporto di glucosio in una linea cellulare megacariocitaria umana (M07), ed abbiamo osservato un'attivazione rapida del trasporto di glucosio da parte di tutti questi stimoli. Vogliamo indagare se le ROS sono coinvolte nella stimolazione acuta del trasporto. Tra i primi obiettivi ci sarà quello di valutare la produzione di ROS in seguito all'interazione dei fattori di crescita con le cellule M07 fattore-dipendenti per poi passare alla linea B1647, sempre di derivazione megacariocitaria, ma fattore-indipendente, e vedere se la formazione di ROS è in relazione con l'attivazione del trasporto passivo di glucosio mediato dalla isoforma GLUT1. Per indagare il/i sito/i di formazione delle ROS, intra e/o extracellulari, verranno usati inibitori delle lipossigenasi, della NAD(P)H ossidasi, famiglia dei sistemi tPMET omologa alla NADPH ossidasi dei fagociti, e della catena respiratoria. Gli stessi inibitori verranno saggiati sull'attività di GLUT. Inoltre si cercherà di discriminare se la stimolazione del trasportatore da parte dei fattori è causata da un'aumentata presenza di GLUT nella membrana dovuta a traslocazione da siti intracellulari o ad un'aumentata affinità. L'uso di opportuni antiossidanti quali EUK-134, mimetico delle SOD e catalasi, CAPE, scavenger di H2O2 ed inibitore della NOS, ebselen, mimetico della glutatione perossidasi, confermeranno il coinvolgimento di ROS nella mediazione di segnali che portano all'attivazione di GLUT1. Cercheremo anche di produrre cellule M07 rho0, cioe' prive di DNA mitocondriale, che consentono la discriminazione delle sorgenti di ROS. 2) Molto recentemente sono stati sintetizzati nuovi antiossidanti interruttori di catena piu' efficaci dell'alfa-tocoferolo e stabili all'aria, i 5-pirimidinoli e i 6-amino-3-piridinoli. La nostra intenzione e' di studiare l'effetto antiossidante di alcuni composti di queste due serie in liposomi e cellule in coltura per verificare se il meccanismo e l'efficienza antiossidante rimangono invariati in questi modelli sperimentali che mimano rispettivamente le membrane naturali e i sistemi in vivo. Inoltre, sara' importante valutare un'eventuale tossicita' di tali composti. Utilizzeremo la diclorofluoresceina diacetato e la idroetidina per determinare col citofluorimetro rispettivamente i perossidi e il superossido intracellulari. La produzione extracellulare di H2O2 verrà misurata fluorimetricamente in base alla dimerizzazione H2O2-dipendente dell'acido omovanillico. Spettrofotometricamente valuteremo l...
L. Landi (2004). Ruolo delle specie reattive dell'ossigeno nella biosegnalazione e nel danno cellulare.
Ruolo delle specie reattive dell'ossigeno nella biosegnalazione e nel danno cellulare
LANDI, LAURA
2004
Abstract
Un numero sempre maggiore di evidenze sperimentali suggerisce che le specie reattive dell'ossigeno (ROS) non sono esclusivamente sottoprodotti citotossici del metabolismo ma sono coinvolte in meccanismi di segnalazione e regolazione cellulare. Questo apparente paradosso del ruolo delle ROS può essere correlato, almeno in parte, alla differenza di concentrazione delle specie prodotte. 1) Le sorgenti cellulari di ROS, che agirebbero come messaggeri intracellulari in seguito all'attivazione dei recettori di membrana da parte citochine, fattori di crescita e ormoni, sembrano essere localizzate nella membrana plasmatica. La produzione di queste specie ossidanti potrebbe avvenire tramite sistemi di trasporto elettronico della membrana plasmatica (tPMET), la cui natura e ruolo fisiologico negli eucarioti sono ancora poco chiari. Un'altra fonte risiede nel metabolismo dei fosfolipidi di membrana: in particolare, la lipossigenasi può essere responsabile della formazione di intermedi radicalici. 2) Oltre alla generazione endogena di ROS come conseguenza di attività metabolica, molti stimoli esterni, tra i quali radiazioni UV, agenti chemioterapici, etc. generano ROS, che possono perturbare il normale bilancio redox e portare le cellule ad uno stato di stress ossidativo. Il programma prenderà in considerazione questo duplice ruolo delle ROS. 1) In un lavoro precedente abbiamo visto che l'H2O2 è in grado di mimare l'effetto di alcune citochine (TPO, GM-CSF, SCF) sul trasporto di glucosio in una linea cellulare megacariocitaria umana (M07), ed abbiamo osservato un'attivazione rapida del trasporto di glucosio da parte di tutti questi stimoli. Vogliamo indagare se le ROS sono coinvolte nella stimolazione acuta del trasporto. Tra i primi obiettivi ci sarà quello di valutare la produzione di ROS in seguito all'interazione dei fattori di crescita con le cellule M07 fattore-dipendenti per poi passare alla linea B1647, sempre di derivazione megacariocitaria, ma fattore-indipendente, e vedere se la formazione di ROS è in relazione con l'attivazione del trasporto passivo di glucosio mediato dalla isoforma GLUT1. Per indagare il/i sito/i di formazione delle ROS, intra e/o extracellulari, verranno usati inibitori delle lipossigenasi, della NAD(P)H ossidasi, famiglia dei sistemi tPMET omologa alla NADPH ossidasi dei fagociti, e della catena respiratoria. Gli stessi inibitori verranno saggiati sull'attività di GLUT. Inoltre si cercherà di discriminare se la stimolazione del trasportatore da parte dei fattori è causata da un'aumentata presenza di GLUT nella membrana dovuta a traslocazione da siti intracellulari o ad un'aumentata affinità. L'uso di opportuni antiossidanti quali EUK-134, mimetico delle SOD e catalasi, CAPE, scavenger di H2O2 ed inibitore della NOS, ebselen, mimetico della glutatione perossidasi, confermeranno il coinvolgimento di ROS nella mediazione di segnali che portano all'attivazione di GLUT1. Cercheremo anche di produrre cellule M07 rho0, cioe' prive di DNA mitocondriale, che consentono la discriminazione delle sorgenti di ROS. 2) Molto recentemente sono stati sintetizzati nuovi antiossidanti interruttori di catena piu' efficaci dell'alfa-tocoferolo e stabili all'aria, i 5-pirimidinoli e i 6-amino-3-piridinoli. La nostra intenzione e' di studiare l'effetto antiossidante di alcuni composti di queste due serie in liposomi e cellule in coltura per verificare se il meccanismo e l'efficienza antiossidante rimangono invariati in questi modelli sperimentali che mimano rispettivamente le membrane naturali e i sistemi in vivo. Inoltre, sara' importante valutare un'eventuale tossicita' di tali composti. Utilizzeremo la diclorofluoresceina diacetato e la idroetidina per determinare col citofluorimetro rispettivamente i perossidi e il superossido intracellulari. La produzione extracellulare di H2O2 verrà misurata fluorimetricamente in base alla dimerizzazione H2O2-dipendente dell'acido omovanillico. Spettrofotometricamente valuteremo l...I documenti in IRIS sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.
