Negli eucarioti fotosintetici alcuni enzimi del ciclo di organicazione del carbonio interagiscono fisicamente a formare dei complessi supramolecolari. La formazioni di tali complessi ha un effetto sull’attività cinetica dei singoli enzimi tale che la formazione/distruzione reversibile dei complessi rappresenta una importante possibilità di regolazione coordinata. Noi ci proponiamo di studiare l’interazione tra la gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) e la fosforibulochinasi (PRK) mediata da un piccolo peptide dei cloroplasti noto come CP12. I cloni necessari per ottenere in forma ricombinante tutte le componenti proteiche del complesso GAPDH/CP12/PRK sia di Spinacia oleracea che di Arabidopsis thaliana sono in gran parte già disponibili e saranno condivisi tra i laboratori dei proponenti. L’effetto delle interazioni tra GAPDH, PRK e CP12 sarà indagato da un punto di vista cinetico e sarà analizzato l’effetto regolativo di tioredossine e altri effettori noti della GAPDH. Le strutture cristallografiche della GAPDH fotosintetica e della PRK sono note, ma non è nota quella del CP12. In collaborazione con il gruppo di cristallografi delle proteine della nostra Università (Ripamonti, Fermani, Falini, Sabatino), con cui abbiamo recentemente ottenuto la prima struttura di GAPDH fotosintetica (Fermani et al., 2001, J Mol Biol, 314: 527), intendiamo tentare la cristallizzazione e successiva analisi tridimensionale del CP12 espresso in forma ricombinante. Gli esperimenti saranno condotti sia sul CP12 isolato che in presenza di subunità di GAPDH, allo scopo di tentare la co-cristallizzazione. Per la comprensione dell’architettura e funzionalità del complesso GAPDH/CP12/PRK sarà utile combinare i dati cinetici con quelli strutturali, ed estendere l’indagine anche a possibili mutanti sito-specifici. Sarà inoltre essenziale integrare questo approccio molecolare con gli studi fisiologici che si condurranno nel Laboratorio della Prof. R. Scheibe, con lo scopo di individuare e caratterizzare con metodi immunologici e cromatografici il complesso GAPDH/CP12/PRK in piante di Arabidopsis wild-type e in mutanti per inserzione di T-DNA (knock-out) con espressione alterata di geni CP12.
Complessi supramolecolari di enzimi fotosintetici / P. Trost. - (2005).
Complessi supramolecolari di enzimi fotosintetici
TROST, PAOLO BERNARDO
2005
Abstract
Negli eucarioti fotosintetici alcuni enzimi del ciclo di organicazione del carbonio interagiscono fisicamente a formare dei complessi supramolecolari. La formazioni di tali complessi ha un effetto sull’attività cinetica dei singoli enzimi tale che la formazione/distruzione reversibile dei complessi rappresenta una importante possibilità di regolazione coordinata. Noi ci proponiamo di studiare l’interazione tra la gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) e la fosforibulochinasi (PRK) mediata da un piccolo peptide dei cloroplasti noto come CP12. I cloni necessari per ottenere in forma ricombinante tutte le componenti proteiche del complesso GAPDH/CP12/PRK sia di Spinacia oleracea che di Arabidopsis thaliana sono in gran parte già disponibili e saranno condivisi tra i laboratori dei proponenti. L’effetto delle interazioni tra GAPDH, PRK e CP12 sarà indagato da un punto di vista cinetico e sarà analizzato l’effetto regolativo di tioredossine e altri effettori noti della GAPDH. Le strutture cristallografiche della GAPDH fotosintetica e della PRK sono note, ma non è nota quella del CP12. In collaborazione con il gruppo di cristallografi delle proteine della nostra Università (Ripamonti, Fermani, Falini, Sabatino), con cui abbiamo recentemente ottenuto la prima struttura di GAPDH fotosintetica (Fermani et al., 2001, J Mol Biol, 314: 527), intendiamo tentare la cristallizzazione e successiva analisi tridimensionale del CP12 espresso in forma ricombinante. Gli esperimenti saranno condotti sia sul CP12 isolato che in presenza di subunità di GAPDH, allo scopo di tentare la co-cristallizzazione. Per la comprensione dell’architettura e funzionalità del complesso GAPDH/CP12/PRK sarà utile combinare i dati cinetici con quelli strutturali, ed estendere l’indagine anche a possibili mutanti sito-specifici. Sarà inoltre essenziale integrare questo approccio molecolare con gli studi fisiologici che si condurranno nel Laboratorio della Prof. R. Scheibe, con lo scopo di individuare e caratterizzare con metodi immunologici e cromatografici il complesso GAPDH/CP12/PRK in piante di Arabidopsis wild-type e in mutanti per inserzione di T-DNA (knock-out) con espressione alterata di geni CP12.I documenti in IRIS sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.
