Il parvovirus B19 è un virus ampiamente diffuso nella popolazione ed implicato in un ampio spettro di situazioni patologiche quali l’eritema infettivo, artropatie, anemie emolitiche e crisi aplastiche transitorie. L’infezione è anche associata a manifestazioni cliniche rare come miocarditi, epatiti, encefaliti, sindrome da stanchezza cronica e alcune malattie autoimmunitarie. Nella donna in gravidanza l’infezione può portare allo sviluppo di idrope fetale non immune, aborto spontaneo e morte fetale. La diagnosi tempestiva di infezione virale mediante sistemi “Point-of-Care Testing”potrebbe essere utile per aumentare l’accuratezza del percorso diagnostico. A tale scopo, è stato sviluppato un dispositivo analitico miniaturizzato per la ricerca del DNA virale che sfrutta la tecnologia microarray e la chemiluminescenza come sistema di rivelazione. Il dispositivo si compone di un reaction chip costituito da un vetrino portaoggetto attivato chimicamente e funzionalizzato con sonde oligonucleotidiche per la cattura del DNA, integrato ad elementi fluidici (microcanali e reservoirs), e da una CCD camera modificata per la rivelazione del segnale chemiluminescente. Il metodo prevede, dopo PCR e marcatura con biotina degli amplificati, l’iniezione del prodotto denaturato nel microcanale del chip, in cui fluisce ibridandosi alle sonde immobilizzate sul supporto di vetro. Successivamente l’ibrido marcato con biotina è rivelato mediante l’aggiunta di avidina coniugata a perossidasi, e del substrato chemiluminescente. Il segnale luminoso è quindi catturato con la CCD camera ed analizzato. Le reazioni di ibridazione e di rivelazione dell’ibrido si effettuano sul chip, lungo i microcanali del modulo fluidico, sfruttando la forza capillare, con tempi e volumi estremamente ridotti rispetto a quelli dei saggi convenzionali in formato ELISA. Le performance analitiche del dispositivo sono state valutate analizzando degli amplificati a concentrazione nota marcati in PCR, e lo Standard Internazionale per il DNA di B19 (NIBSC 99/800). In seguito, 50 campioni clinici (sieri di riferimento precedentemente testati in PCR-ELISA) sono stati analizzati, previa amplificazione. Il sistema analitico per la rivelazione del DNA di parvovirus B19 ha dimostrato una sensibilità del 91.9%, una specificità del 92.3%, con un valore predittivo positivo del 97.1% e negativo dell’ 80.0%.
Sviluppo di un dispositivo analitico miniaturizzato “Point-of-Care Testing” per la diagnosi di infezione da parvovirus B19
BONVICINI, FRANCESCA;MANARESI, ELISABETTA;DI FURIO, FRANCESCA;GENTILOMI, GIOVANNA ANGELA;GALLINELLA, GIORGIO;MIRASOLI, MARA;ZANGHERI, MARTINA;RODA, ALDO
2012
Abstract
Il parvovirus B19 è un virus ampiamente diffuso nella popolazione ed implicato in un ampio spettro di situazioni patologiche quali l’eritema infettivo, artropatie, anemie emolitiche e crisi aplastiche transitorie. L’infezione è anche associata a manifestazioni cliniche rare come miocarditi, epatiti, encefaliti, sindrome da stanchezza cronica e alcune malattie autoimmunitarie. Nella donna in gravidanza l’infezione può portare allo sviluppo di idrope fetale non immune, aborto spontaneo e morte fetale. La diagnosi tempestiva di infezione virale mediante sistemi “Point-of-Care Testing”potrebbe essere utile per aumentare l’accuratezza del percorso diagnostico. A tale scopo, è stato sviluppato un dispositivo analitico miniaturizzato per la ricerca del DNA virale che sfrutta la tecnologia microarray e la chemiluminescenza come sistema di rivelazione. Il dispositivo si compone di un reaction chip costituito da un vetrino portaoggetto attivato chimicamente e funzionalizzato con sonde oligonucleotidiche per la cattura del DNA, integrato ad elementi fluidici (microcanali e reservoirs), e da una CCD camera modificata per la rivelazione del segnale chemiluminescente. Il metodo prevede, dopo PCR e marcatura con biotina degli amplificati, l’iniezione del prodotto denaturato nel microcanale del chip, in cui fluisce ibridandosi alle sonde immobilizzate sul supporto di vetro. Successivamente l’ibrido marcato con biotina è rivelato mediante l’aggiunta di avidina coniugata a perossidasi, e del substrato chemiluminescente. Il segnale luminoso è quindi catturato con la CCD camera ed analizzato. Le reazioni di ibridazione e di rivelazione dell’ibrido si effettuano sul chip, lungo i microcanali del modulo fluidico, sfruttando la forza capillare, con tempi e volumi estremamente ridotti rispetto a quelli dei saggi convenzionali in formato ELISA. Le performance analitiche del dispositivo sono state valutate analizzando degli amplificati a concentrazione nota marcati in PCR, e lo Standard Internazionale per il DNA di B19 (NIBSC 99/800). In seguito, 50 campioni clinici (sieri di riferimento precedentemente testati in PCR-ELISA) sono stati analizzati, previa amplificazione. Il sistema analitico per la rivelazione del DNA di parvovirus B19 ha dimostrato una sensibilità del 91.9%, una specificità del 92.3%, con un valore predittivo positivo del 97.1% e negativo dell’ 80.0%.I documenti in IRIS sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.
