L'Epatite E è una malattia infettiva con caratteristiche cliniche di epatite acuta. L'agente eziologico responsabile è il virus dell'epatite E (Hepatitis E Virus, HEV), attualmente classificato nel genere hepevirus. L'HEV è un virus a RNA monocatenario, e il genoma codifica per le proteine non strutturali (ORF1), la proteina capsidica maggiore (ORF2) e per una proteina con funzioni non note (ORF3). La malattia è considerata endemica nei Paesi in via di sviluppo, dove causa epidemie generalmente associate al consumo di acqua contaminata. Inizialmente i casi di HEV in adulti nei Paesi industrializzati erano associati pazienti con una storia recente di viaggi all'estero. Di recente, casi sporadici di origine autoctona sono stati descritti in diversi Paesi industrializzati, compresa l'Italia. Il virus è stato identificato in diversi animali domestici (suino) e selvatici (cervidi, cinghiale). Una possibile origine zoonotica con trasmissione del virus dal suino all'uomo è suggerita da evidenze epidemiologiche e virologiche. Ad oggi non esiste un sistema cellulare per la crescita del virus in vitro, limitando conseguentemente gli studi sulla patogenesi e immunologia di HEV. La proteina del capside virale di un ceppo di HEV suino, identificato in Italia, è stata clonata ed espressa nel sistema ricombinante di baculovirus. L'RNA totale è stato estratto da un campione di bile di un suino clinicamente sano (positivo per HEV) e utilizzato per sintetizzare il cDNA mediante trascrizione inversa a partire dalla regione poliA del genoma virale. Il cDNA è stato utilizzato in una reazione di PCR con i primer FΔ111ORF2-RORF2 disegnati al fine di amplificare un frammento corrispondente a una delezione dei primi 111 aa, della regione capsidica (ORF2) di HEV. Questo è stato successivamente clonato nel vettore pfastBAC per l'espressione con il sistema di baculovirus in cellule di insetto Sf9. La presenza della ORF2 all'interno del bacmide e il suo corretto frame di lettura sono stati confermati mediante analisi di sequenza. La proteina è stata inoltre utilizzata per produrre sieri policlonali e anticorpi monoclonali murini.
Espressione della proteina capsidica di un ceppo italiano suino di epatite E / Di Bartolo I.; Ponterio E.; Inglese N.; Martelli F.; Caprioli A.; Ostanello F.; Ruggeri F.M.. - STAMPA. - ISTISAN Congressi 09/C4:(2009), pp. 44-44. (Intervento presentato al convegno 3° Workshop Nazionale di Virologia Veterinaria tenutosi a Bari nel 11-12 Giugno 2009).
Espressione della proteina capsidica di un ceppo italiano suino di epatite E
MARTELLI, FRANCESCA;CAPRIOLI, ANDREA;OSTANELLO, FABIO;
2009
Abstract
L'Epatite E è una malattia infettiva con caratteristiche cliniche di epatite acuta. L'agente eziologico responsabile è il virus dell'epatite E (Hepatitis E Virus, HEV), attualmente classificato nel genere hepevirus. L'HEV è un virus a RNA monocatenario, e il genoma codifica per le proteine non strutturali (ORF1), la proteina capsidica maggiore (ORF2) e per una proteina con funzioni non note (ORF3). La malattia è considerata endemica nei Paesi in via di sviluppo, dove causa epidemie generalmente associate al consumo di acqua contaminata. Inizialmente i casi di HEV in adulti nei Paesi industrializzati erano associati pazienti con una storia recente di viaggi all'estero. Di recente, casi sporadici di origine autoctona sono stati descritti in diversi Paesi industrializzati, compresa l'Italia. Il virus è stato identificato in diversi animali domestici (suino) e selvatici (cervidi, cinghiale). Una possibile origine zoonotica con trasmissione del virus dal suino all'uomo è suggerita da evidenze epidemiologiche e virologiche. Ad oggi non esiste un sistema cellulare per la crescita del virus in vitro, limitando conseguentemente gli studi sulla patogenesi e immunologia di HEV. La proteina del capside virale di un ceppo di HEV suino, identificato in Italia, è stata clonata ed espressa nel sistema ricombinante di baculovirus. L'RNA totale è stato estratto da un campione di bile di un suino clinicamente sano (positivo per HEV) e utilizzato per sintetizzare il cDNA mediante trascrizione inversa a partire dalla regione poliA del genoma virale. Il cDNA è stato utilizzato in una reazione di PCR con i primer FΔ111ORF2-RORF2 disegnati al fine di amplificare un frammento corrispondente a una delezione dei primi 111 aa, della regione capsidica (ORF2) di HEV. Questo è stato successivamente clonato nel vettore pfastBAC per l'espressione con il sistema di baculovirus in cellule di insetto Sf9. La presenza della ORF2 all'interno del bacmide e il suo corretto frame di lettura sono stati confermati mediante analisi di sequenza. La proteina è stata inoltre utilizzata per produrre sieri policlonali e anticorpi monoclonali murini.I documenti in IRIS sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.
