Messa a punto di modelli cellulari umani per lo studio della malattia di Gaucher

La malattia di Gaucher è un disordine monogenico caratterizzato dal deficit dell’enzima β-glucocerebrosidasi. Dal momento che l’innesco aberrante di meccanismi infiammatori cellulari è un aspetto peculiare della malattia, ci siamo concentrati sullo studio del pathway della necroptosi, forma di morte cellulare programmata dettata dall’infiammazione. Dall’analisi dell’espressione genica e dalla valutazione dei livelli proteici in modelli cellulari Gaucher-like, ottenuti tramite inibizione enzimatica, abbiamo evidenziato come la chinasi RIP1, primo effettore della via di segnalazione sia iperattivato nello stato patologico. Per disporre di un sistema d’analisi più accurato stiamo mettendo a punto modelli che sfruttano cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) derivate da paziente e donatore sano. Tramite gene editing la più comune mutazione puntiforme causante la malattia (N370S), è stata inserita in iPSCs derivate da donatore sano. Le cellule sono state trasfettate, tramite nucleofezione, con il plasmide pSpCas9(BB)-2A-Puro codificante per la Cas9 e per una guida a RNA in grado di indirizzarne il taglio sito-specifico. La sequenza stampo per l’inserimento della mutazione è stata introdotta sotto forma di DNA a singolo filamento. La presenza della mutazione è stata verificata tramite PCR effettuata con primer specifici su pool di cellule trasfettate. Parallelamente, da cellule mononucleate del sangue periferico di un paziente Gaucher con mutazione N370S/L444P sono state ottenute iPSCs grazie a trasduzione con i vettori virali Sendai codificanti per i fattori di riprogrammazione: Klf4, cMyc e KOS. Il monitoraggio del differenziamento verso destino ematopoietico sarà portato avanti concentrandosi nello specifico sul tipo cellulare macrofagico in quanto maggior target dell’accumulo sfingolipidico caratterizzante la malattia.