La stimolazione a breve termine del trasportatore di glucosio GLUT1 è una risposta precoce al legame di citochine alla superficie cellulare, oltre che a fattori ambientali quali stress metabolico o ipossia. In cellule emopoietiche la regolazione dell’uptake di glucosio svolge un ruolo centrale nel controllo dell’apoptosi. Oggetto di studio è il trasporto di glucosio in due linee emopoietiche. L'aggiunta di citochine o H2O2 alla linea megacariocitaria M07e provoca l'attivazione di GLUT1; TPO e GM-CSF aumentano l'affinità per il glucosio, mentre SCF ha effetto sia sull'affinità sia su Vmax, significativamente aumentata; anche H2O2 aumenta Vmax. Nella linea eritromegacariocitaria B1647, capace di proliferare anche in assenza di citochine aggiunte, il trasporto non è influenzato dalle citochine saggiate, forse per una "autostimolazione" da fattori prodotti dalle cellule. In tale linea il trasporto avviene con Vmax più elevata in accordo con l’ipotesi di una "stimolazione permanente". Mentre i meccanismi di regolazione del trasportatore insulina-dipendente (GLUT4) sono noti, diverse sono le ipotesi sulla modulazione a breve di GLUT1. Ci si propone di chiarire il meccanismo con cui il trasporto di glucosio è modulato in cellule emopoietiche, ricorrendo ad inibitori di enzimi coinvolti nelle risposte in cascata. È noto che SCF si lega a c-kit, una tirosina chinasi che si autofosforila attivando segnali a valle; l’effetto di tale interazione sul trasporto sarà valutato con STI-571, un potente inibitore di tale attività. Per confronto, saranno impiegati inibitori di chinasi src, che hanno un ruolo nella proliferazione cellulare ed in particolare in risposte suscitate da SCF. Altre chinasi oggetto di indagine saranno PKB/Akt, importante nella trasduzione di segnali extracellulari e coinvolta nell’apoptosi, PYK2 (Tyr chinasi ricca in prolina) e la proteina chinasi AMP-dipendente, correlata all’attivazione di GLUT4. Oltre all’approccio con inibitori, si valuterà, con specifici anticorpi, quali siano le proteine bersaglio nella trasduzione; possibili bersagli di fosforilazioni in cascata sono c-kit, PLCgamma, PKB/Akt, PYK2, Syk e VEGFR. Il ruolo della PLC, implicata nella modulazione di GLUT1, nella formazione di molecole che mediano il rilascio di calcio induce a proseguire lo studio dell’effetto di variazioni di Ca++ citosolico sul trasporto. Nelle cellule M07e sono stati condotti esperimenti preliminari sia con tapsigargina, che inibisce Ca-ATPasi microsomiali aumentando il Ca++ citosolico, sia con un chelante che permea le membrane riducendo il calcio intracellulare. Utilizzeremo sonde fluorescenti quali fura-2 e fluo-3 per avere informazioni su “spikes” di calcio evocati dalla incubazione con citochine o H2O2. L’uso di dantrolene, 2-APB e nifedipina può indicare se l’aumento di calcio citosolico sia dovuto ad un rilascio da depositi nel reticolo endoplasmatico, oppure ad un ingresso di calcio extracellulare. Il coinvolgimento di sistemi calmodulina-dipendenti nella attivazione del trasporto e nella traslocazione di GLUT sarà valutato sia con inibitori della calmodulina (W-7), sia studiando enzimi calcio/calmodulina-dipendenti quali la calcio/calmodulina chinasi II. I dati ottenuti su cellule M07e saranno confrontati con le B1647, per chiarire perché in queste cellule il trasporto di glucosio sia più veloce di quello misurato in M07e; dato che anch’esse risultano sensibili alla genisteina, ci si propone di indagare il loro stato basale di fosforilazione. La risposta a variazioni di Ca++ citosolico verrà studiata con un approccio analogo a quello per le cellule M07e. Sulla base di dati a sostegno della produzione autocrina di VEGF, si accerterà con l’uso di anticorpi contro VEGF o di molecole capaci di bloccarne il recettore se tale produzione sia responsabile della “stimolazione continua” del trasporto in cellule B1647. Come descritto in letteratura, il trasporto di glucosio ha un ruolo fondamentale nell’apoptosi in cellule emopoiet...

Meccanismi di modulazione del trasporto di glucosio in cellule emopoietiche

HAKIM, GABRIELE
2004

Abstract

La stimolazione a breve termine del trasportatore di glucosio GLUT1 è una risposta precoce al legame di citochine alla superficie cellulare, oltre che a fattori ambientali quali stress metabolico o ipossia. In cellule emopoietiche la regolazione dell’uptake di glucosio svolge un ruolo centrale nel controllo dell’apoptosi. Oggetto di studio è il trasporto di glucosio in due linee emopoietiche. L'aggiunta di citochine o H2O2 alla linea megacariocitaria M07e provoca l'attivazione di GLUT1; TPO e GM-CSF aumentano l'affinità per il glucosio, mentre SCF ha effetto sia sull'affinità sia su Vmax, significativamente aumentata; anche H2O2 aumenta Vmax. Nella linea eritromegacariocitaria B1647, capace di proliferare anche in assenza di citochine aggiunte, il trasporto non è influenzato dalle citochine saggiate, forse per una "autostimolazione" da fattori prodotti dalle cellule. In tale linea il trasporto avviene con Vmax più elevata in accordo con l’ipotesi di una "stimolazione permanente". Mentre i meccanismi di regolazione del trasportatore insulina-dipendente (GLUT4) sono noti, diverse sono le ipotesi sulla modulazione a breve di GLUT1. Ci si propone di chiarire il meccanismo con cui il trasporto di glucosio è modulato in cellule emopoietiche, ricorrendo ad inibitori di enzimi coinvolti nelle risposte in cascata. È noto che SCF si lega a c-kit, una tirosina chinasi che si autofosforila attivando segnali a valle; l’effetto di tale interazione sul trasporto sarà valutato con STI-571, un potente inibitore di tale attività. Per confronto, saranno impiegati inibitori di chinasi src, che hanno un ruolo nella proliferazione cellulare ed in particolare in risposte suscitate da SCF. Altre chinasi oggetto di indagine saranno PKB/Akt, importante nella trasduzione di segnali extracellulari e coinvolta nell’apoptosi, PYK2 (Tyr chinasi ricca in prolina) e la proteina chinasi AMP-dipendente, correlata all’attivazione di GLUT4. Oltre all’approccio con inibitori, si valuterà, con specifici anticorpi, quali siano le proteine bersaglio nella trasduzione; possibili bersagli di fosforilazioni in cascata sono c-kit, PLCgamma, PKB/Akt, PYK2, Syk e VEGFR. Il ruolo della PLC, implicata nella modulazione di GLUT1, nella formazione di molecole che mediano il rilascio di calcio induce a proseguire lo studio dell’effetto di variazioni di Ca++ citosolico sul trasporto. Nelle cellule M07e sono stati condotti esperimenti preliminari sia con tapsigargina, che inibisce Ca-ATPasi microsomiali aumentando il Ca++ citosolico, sia con un chelante che permea le membrane riducendo il calcio intracellulare. Utilizzeremo sonde fluorescenti quali fura-2 e fluo-3 per avere informazioni su “spikes” di calcio evocati dalla incubazione con citochine o H2O2. L’uso di dantrolene, 2-APB e nifedipina può indicare se l’aumento di calcio citosolico sia dovuto ad un rilascio da depositi nel reticolo endoplasmatico, oppure ad un ingresso di calcio extracellulare. Il coinvolgimento di sistemi calmodulina-dipendenti nella attivazione del trasporto e nella traslocazione di GLUT sarà valutato sia con inibitori della calmodulina (W-7), sia studiando enzimi calcio/calmodulina-dipendenti quali la calcio/calmodulina chinasi II. I dati ottenuti su cellule M07e saranno confrontati con le B1647, per chiarire perché in queste cellule il trasporto di glucosio sia più veloce di quello misurato in M07e; dato che anch’esse risultano sensibili alla genisteina, ci si propone di indagare il loro stato basale di fosforilazione. La risposta a variazioni di Ca++ citosolico verrà studiata con un approccio analogo a quello per le cellule M07e. Sulla base di dati a sostegno della produzione autocrina di VEGF, si accerterà con l’uso di anticorpi contro VEGF o di molecole capaci di bloccarne il recettore se tale produzione sia responsabile della “stimolazione continua” del trasporto in cellule B1647. Come descritto in letteratura, il trasporto di glucosio ha un ruolo fondamentale nell’apoptosi in cellule emopoiet...
2004
Hakim G
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